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糖尿病是由于胰岛素分泌不足,胰岛素作用异常或二者兼有而导致的以高血糖为主要临床特点的一组代谢性疾病。2型糖尿病现已成为全球性重大公共卫生问题,目前的研究结果表明血糖调节不仅与胰腺、肝脏、肌肉和脂肪的作用及相互作用有关而且与免疫系统、大脑和消化道所发出的信号有关,更有新的研究结果显示成骨细胞特异性分泌的蛋白——骨钙素(Osteocalcin,Bone Gla protein,BGP,OC)在血糖调节中也发挥了重要的作用。
骨钙素为成骨细胞特异性分泌的一种蛋白,在维生素K依赖性羧化酶的作用下,其17,21,24位上的谷氨酸残基羧化为羧化谷氨酸,含有未羧化谷氨酸残基的骨钙素称为羧化不全骨钙素。此外骨钙素羧化还受成骨细胞特异性表达基因Esp(亦称PTPRV)基因编码的一个新的受体样酪氨酸磷酸酶OST-PTP蛋白(Osteotesticular Protein Tyrosine Phosphatase)的调节。
既往研究多认为骨钙素是骨形成及骨转换的标志,然而既往的研究只是将骨钙素做为骨转换的标志从其在糖尿病人群中的变化的角度来研究糖尿病患者的骨代谢,并没有注意到它可能会影响糖脂代谢。直到Lee等(2007)在骨钙素基因缺失的小鼠上发现这些小鼠较野生型小鼠血糖水平升高、胰岛素水平降低、胰岛素敏感性降低、胰岛细胞增殖减少,能量支出减少,不能耐受血糖并且肥胖,人们才注意到骨钙素可能是一种骨组织分泌的激素参与能量代谢的调节,且只有羧化不全骨钙素才具有促进胰岛素分泌、增强胰岛素敏感性而且可降低血清甘油三酯含量及体内脂肪的含量。推测成骨细胞可感知血糖浓度的变化并能通过调节羧化不全骨钙素水平来参与血糖调节。本实验拟探讨在不同浓度的葡萄糖培养基中成骨细胞羧化不全骨钙素分泌水平的变化。
越来越多的临床研究发现2型糖尿病多伴有骨钙素水平的变化,2型糖尿病患者血清骨钙素水平明显降低,且与骨密度无关,在血糖控制改善后其水平恢复正常。在健康者的横断面研究表明体质指数BMI<25/kg/m2个体其循环中骨钙素水平与胰岛素敏感性成线性关系。在绝经后的妇女的研究表明2型糖尿病患者其骨钙素水平较血糖正常者及IGT患者其骨钙素水平明显降低。骨钙素处于最高四分位值者其空腹血糖及糖化血红蛋白水平较骨钙素处于最低四分位值者明显降低。此外骨钙素水平与血糖、胰岛素、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗成负相关,多元回归分析表明血清骨钙素是与血糖、糖化血红蛋白相关的独立的因子。在老年人中的研究发现血清骨钙素浓度与空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数、体重指数、体脂呈负相关。本研究拟比较不同糖耐量者其骨钙素水平并探讨骨钙素与各代谢相关指标的相关性。
本课题拟探讨以下两个方面的内容:
1.成骨细胞对血糖感知作用:探讨在不同浓度的葡萄糖情况下成骨细胞羧化不全骨钙素分泌水平的变化。
2.比较不同糖耐量者其骨钙素水平并探讨骨钙素与各代谢相关指标的相关性。
第1章成骨细胞对血糖感知作用的研究
1.研究目的
探讨不同浓度的血糖情况下成骨细胞羧化不全骨钙素分泌水平的变化。
2.材料和方法
2.1实验材料
2.1.1肋骨标本
来自胸部创伤手术切除之肋骨,取标本前获得患者及其家属知情同意。
2.2实验方法
2.2.1人成骨细胞的分离和培养
将手术切除之肋骨以PBS彻底清洗,清除软组织,将其咬碎,暴露小梁骨面,切下骨小梁并将之剪碎,置于培养皿中,将骨小梁以无菌的PBS彻底清洗以移除血液成分,以0.25％胰酶(含0.02％EDTA)于37℃消化半小时,终止消化并以PBS彻底冲洗直至于倒置显微镜下观察骨片表面及清洗液中无粘着及漂浮的细胞,以DMEM完全培养液清洗骨小梁一次,将其移入培养瓶内培养,补足培养液密闭后置5％CO2、37℃饱和湿度下培养,每周更换培养液一次。
2.2.2人成骨细胞的鉴定
2.2.2.1碱性磷酸酶组织化学染色-偶氮偶联法
参照李家增主编《血液实验学》之Kaplow偶氮偶联染色法并加以改良。
2.2.2.2骨钙素免疫荧光组化染色
依照免疫荧光组化染色步骤进行。
2.2.2.3钙-茜素红染色:
参照Thomas染色法
2.2.3不同浓度葡萄糖对成骨细胞羧化不全骨钙素分泌水平的影响
2.2.3.1细胞分组及处理
将传二三代成骨细胞以5×104个细胞接种于6孔板中分成5组,待细胞融合至80％以含不同浓度葡萄糖的培养基(浓度分别为5.6,7.6,9.6,12.6,20.6mmol/L)刺激成骨细胞并同时加入维生素K2使其在培养液中的最终浓度为10-5mol/L,半小时后收集上清液-20℃冰箱冻存待用,观察血糖对成骨细胞羧化不全骨钙素分泌水平的影响。
2.2.3.2上清中羧化不全骨钙素率
2.2.3.2.1上清中总骨钙素水平测定:
按骨钙素测定放免试剂盒说明书进行。
2.2.3.2.2上清中羧化不全骨钙素测定(依照Sokoll’法)
同步取100μL上清液,加入100g/L硫酸钡100μL,振荡30min,4℃离心5min,按骨钙素测定放免试剂盒说明书进行测定上清液中羧化不全骨钙素含量。
2.2.3.2.3羧化不全骨钙素率计算
羧化不全骨钙素率=羧化不全骨钙素/骨钙素×100％。
2.2.4统计学分析:
应用SPSS13.0软件进行统计学分析,采用One—way ANOVA,组间比较用SNK法,检验水准取α=0.05。
3.结论
在一定葡萄糖浓度范围内(5.6～9.6 mmol/L)成骨细胞羧化不全骨钙素分泌水平随葡萄糖浓度增加而增加,而当进一步提高葡萄糖浓度20.6 mmol/L时成骨细胞分泌羧化不全骨钙素水平反而降低。
第2章不同糖耐量者血清骨钙素水平的比较性研究
1.研究目的
比较不同糖耐量者其骨钙素水平并探讨骨钙素与各代谢相关指标的相关性。
2.研究方法
2.1对象
根据WHO1999年诊断标准,收集门诊及住院患者,其中正常糖耐量组(NGT)13人、空腹血糖调节受损组(IFG)10人、新诊断的2型糖尿病(172DM)29人,排除肝硬化、肿瘤、肾功能异常、曾患骨折及服用影响骨代谢的药物(二膦酸盐、降钙素、雌激素、阿法骨化醇)及绝经妇女。
所有受试者均于电子体重计上赤足测定身高和体重,并根据公式:体重(Kg)/身高平方米(m2)计算BMI(Rg/m2)。
2.2.2口服葡萄糖耐量.胰岛素释放试验(OGTT)
受试者禁食至少12小时后在清晨空腹抽取肘静脉血,然后口服75克葡萄糖(溶于300ml水中,5分钟内饮完),2小时后再抽取肘静脉血。采用葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度,化学发光法测定血浆胰岛素水平。
2.2.3计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)
胰岛素抵抗指数HOMA-IR=(FINS×FPG)/22.5。
2.2.4生化分析
同步采集受试者患者的血液样品。于全自动生化分析仪上测定总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、糖化血红蛋白(HbA1c)。
2.2.5骨钙素测定:
按试剂盒说明书进行。
2.3统计学处理
统计学方法包括方差分析、协方差分析,相关分析,统计处理均使用软件SPSS13.0统计软件进行分析。各项参数以x±sD表示。不同组别间的比较采用单因素方差分析,BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、HbA1c及HOMA-IR与BGP的相关性比较采用Person相关分析。
3.结论
本研究表明三组之间骨钙素水平比较有统计学意义,NGT、IGT、T2DM组彼此之间有统计学意义,经过年龄、胰岛素水平校正后三组之间及各组别之间仍有统计学意义。2型糖尿病患者其骨钙素水平较血糖正常者及IGT患者其骨钙素水平明显降低,其浓度从NGT到IGT再到糖尿病逐渐降低。相关分析表明骨钙素与空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1C)、HOMA-IR成负相关。骨钙素与TC、LDL-C成负相关,但相关关系不密切。骨钙素与体重指数、空腹胰岛素、TG、HDL-C无相关关系。骨钙素在血糖调节方面可能有潜在的作用,骨钙素可能作为内分泌系统的一部分参与能量代谢的调节。
总结
1.成骨细胞可感知葡萄糖浓度的变化并调节自身羧化不全骨钙素分泌水平。在一定葡萄糖浓度范围内(5.6～9.6 mmol/L)成骨细胞羧化不全骨钙素分泌水平随葡萄糖浓度增加而增加,而当进一步提高葡萄糖浓度达20.6 mmol/L时成骨细胞分泌羧化不全骨钙素水平反而降低。
2.2型糖尿病患者其骨钙素水平较血糖正常者及IGT患者其骨钙素水平明显降低。相关分析表明骨钙素与空腹血糖、糖化血红蛋白(HbA1C)、HOMA-IR成负相关。骨钙素与TC、LDL-C成负相关,但相关关系不密切。骨钙素与体重指数、空腹胰岛素、TG、HDL-C无相关关系。骨钙素在血糖调节方面可能有潜在的作用,骨钙素可能作为内分泌系统的一部分参与能量代谢的调节。