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L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine简写L-Phe)是一种对人和动物具有重要作用的必需氨基酸,由于在体内无法自行合成,需要通过食物摄取补给来满足生长所需。因此在食品,医药,营养保健品甚至日用化妆品等领域都有广泛的应用。目前工业上生产L-Phe的方法主要为微生物发酵法,葡萄糖由于价格低廉易被菌体消耗常作为L-Phe发酵的生产原料。但是菌体利用葡萄糖生产L-Phe的得率较低,即使采用最常用的酪氨酸缺陷菌株,其糖酸转化率也只有0.275g-g-1。利用基因敲除的方法对L-Phe生产菌株进一步改造,敲除ppc基因,阻断磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate简写PEP)进入三羧酸循环(TCAcycle)的回补途径,在理论上积累更多PEP进入L-Phe合成代谢,从而提高糖酸转化率。本实验分别利用原始酪氨酸缺陷型菌株及改造后的ppc基因缺陷菌株,考察菌株的发酵性能,找到提高L-Phe发酵得率的影响因素并对发酵过程进行优化。主要工作如下：1、ppc基因缺陷菌株因缺少回补途径造成TCA循环中间物质合成不足,无法在M9发酵培养基中生长。实验发现L-谷氨酸,L-天冬氨酸,柠檬酸均有促进菌体生长作用。通过考察添加不同浓度外源物质对菌株生长及L-Phe生物合成的效果对比,选择在培养基中补充1g·L-1浓度L-谷氨酸配制复合培养基以满足菌体的生长所需。摇瓶发酵结果显示,与非敲除ppc菌株对照,发酵12h生物量为对照菌株的1.17倍,L-Phe浓度为对照菌株的1.15倍。2、ppc单基因缺陷菌株,由于回补途径的缺失造成进入PEP生成丙酮酸进而产乙酸的代谢支路得到增强,乙酸大量生成而L-Phe生物合成受阻,无法实现发酵生产L-Phe。对于同时敲除pykA, pykF基因(控制丙酮酸激酶的表达)的菌株,由于抑制了乙酸合成途径从而保障了PEP进入芳香族氨基酸合成路径,是作为L-Phe发酵生产的优势菌株。3、L-Phe发酵生产属于菌体生长相关型。本文选择补料批式发酵法运用2.5L小型通气发酵罐进行发酵生产工艺研究。发酵过程采用容氧平衡控制法(DO-stat)的补料策略,通过搅拌和补料协同控制来维持恒定的溶氧水平,满足菌体生长需求。发酵37小时菌体干重达到12.7g·L-1,L-Phe终产量22.4g.L-1,葡萄糖对L-Phe转化率实现0.33g.g-1,达到理论转化率72%,是ppc非敲除菌株1.74倍。相对于非敲除对照菌株26.6g.L-1菌体干重,改造后的菌株以更低的菌体生物量实现L-Phe发酵生产。因其好氧需求小,节约设备能源上投入,具有经济优势。