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白藜芦醇作为一种天然活性物质,具有抗肿瘤、防治动脉粥样硬化、心脑血管疾病等功效,但其在自然界中含量较低,因此通过生物转化提高白藜芦醇含量成为近年研究热点。自然界中虎杖苷含量较高,可利用微生物产生的β-葡萄糖苷酶将其转化为为白藜芦醇,提高白藜芦醇的产量。本文对具有转化虎杖苷为白藜芦醇能力的菌种进行了筛选鉴定,并对其产酶条件、酶的分离纯化方法及其固定化进行了研究,为天然产物生物转化理论的研究提供了依据,也为白藜芦醇的生物转化生产提供了方法,具有深远的意义。
(1)菌种的筛选研究。通过虎杖苷液体培养基富集能产生β-葡萄糖苷酶的菌种,然后通过虎杖苷固体培养基水解圈法,结合TLC和HPLC检测筛选目的菌种,最后通过平板划线获得单菌落,并检测单菌落形成虎杖苷水解圈的能力。最终获得一株能产生β-葡萄糖苷酶的菌种,命名为S-4,该菌种能有效的将虎杖苷转化为白藜芦醇,且所产酶在室温条件下较稳定,为该酶的分离纯化创造了良好条件。
(2)菌种鉴定研究。通过菌种形态观察、显微观察和18SrDNA序列分析法对菌种进行了鉴定,其在察氏培养基上,菌落呈青绿色,圆形,中间有突起,边缘呈白色,显微观察发现基部无足细胞,顶端不形成膨大的顶囊,其分生孢子梗经过多次分枝,产生几轮对称或不对称的小梗,形如扫帚。18SrDNA序列分析表明其与卡门培尔青霉具有99%以上的相似度。综合三者的结果,鉴定其为卡门培尔青霉(Penicillium camemberti)。
(3)培养条件优化研究。对菌种产酶条件进行了研究,首先通过对碳源、氮源、初始pH、培养温度、溶氧量、接种量进行了单因素试验,然后通过单方差分析选择影响因素最大的四个因素进行了正交优化试验,优化结果表明:秸秆为碳源、蛋白胨为氮源、pH=5.0、28℃培养条件、装液量为50mL、接种量为3mL条件下,培养液具有最大酶活,达到140.241U/mL。
(4)转化酶的分离纯化研究。对培养液中所产生的β-葡萄糖苷酶进行了分离纯化。首先采用硫酸铵分级沉淀对培养液中的酶进行了分离,酶活测定表明:40-60%浓度范围沉淀的酶具有最高活力,通过葡聚糖凝胶柱层析对酶进行了纯化,并通过SDS-PAGE对酶进行了分子量测定,该酶的分子量为44KDa。
(5)转化酶的固定化研究。对培养液中硫酸铵沉淀的粗酶采用海藻酸钠包埋法进行了固定化,并对固定化条件进行了单因素考察与正交优化。研究结果表明:海藻酸钠浓度为2.00%、氯化钙浓度为2.50%、颗粒度为0.317mm内径的针头、固定化时间为6h时固定化酶具有最大酶活力;对固定化酶的催化能力进行了研究,表明固定化酶在最佳pH和最佳催化温度上未有明显偏移,且适用范围有所扩大。