井冈霉素发酵过程研究

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井冈霉素是由吸水链霉菌井冈变种产生的一种农用抗生素,自20世纪70年代问世以来,就被开发成为有效防治水稻纹枯病的生物农药。由于其低毒、高效、不易产生耐药性,使得其应用十分广泛。此外,井冈霉素的降解产物有效霉烯胺还可作为糖尿病治疗药物阿卡波糖和伏格列波糖的前体。井冈霉素生物合成和调节机制的深入研究,已经能够让我们深入到分子水平上去揭示其发酵过程。而通过在发酵动力学水平,基因表达和酶活水平上详细研究不同发酵策略对吸水链霉菌5008发酵生产井冈霉素的影响,将会为深入了解其生物合成及调节机制提供信息,指导新发酵策略的开发。但目前关于不同发酵条件对井冈霉素的积累过程及其生物合成基因表达和相关酶活的影响尚缺乏深入研究。因此,研究井冈霉素发酵过程和基因表达与代谢调控具有重要的理论和应用价值。目前在吸水链霉菌井冈变种5008中井冈霉素产量还比较低,因此通过优化其发酵过程,可找到影响其产量的重要因子,将为深入了解不同发酵条件对其合成调节机制及进一步提高发酵产量提供依据。氮源在许多抗生素发酵过程中起着重要作用,但在井冈霉素合成过程中,氮源对其发酵动力学,结构基因转录和酶活水平的影响尚缺乏深入研究。本论文首先通过单因子实验和Plackett-Burman设计筛选培养基组分中对井冈霉素产量有重要影响的因子。经过统计学分析,发现玉米粉、黄豆饼粉和酵母粉的含量对井冈霉素产量有显著影响。进一步通过响应面法优化了它们的浓度,从而得到优化后的培养基配方。经实验验证,井冈霉素产量在优化后的培养基中提高了70%左右,由原来的7.5g/L提高到12.6g/L。通过分析优化前后培养基组分的差异,发现优化后培养基中较低的氮源浓度可能是引起井冈霉素产量提高的重要原因。因而在优化后培养基中分别添加黄豆饼粉、酵母粉、胰蛋白胨和牛肉膏四种氮源,发现不同氮源的添加都在一定程度上抑制了井冈霉素的产量,从而证明了氮源浓度对井冈霉素的重要调节作用。通过分析两种培养基中细胞生长、井冈霉素产量、结构基因转录及前体代谢相关酶活的差异,发现在优化后培养基中井冈霉素产量和结构基因的转录都有较大提高,而细胞生长和与前体代谢相关酶活并未有显著变化。此结果暗示结构基因的表达可能在井冈霉素发酵过程中起重要作用。在许多植物细胞次级代谢产物合成过程中,氧化压力的施加能激活相应的信号转导机制,从而促进次级代谢相关基因的表达,进而提高其发酵产量。但在链霉菌中,氧化压力的施加能否通过诱导相应的结构基因的表达进而提高抗生素发酵产量尚不清楚。因此,本论文通过外源添加过氧化氢,施加氧化压力,期望以此提高井冈霉素的发酵产量。首先通过优化过氧化氢的添加时间和添加浓度,发现当在发酵第8小时添加25μM的过氧化氢时,井冈霉素产量有40%左右的提高。通过活性氧抑制剂氯化二亚苯基碘嗡(DPI)的添加及胞内活性氧水平的检测,表明过氧化氢的添加诱导了胞内活性氧水平的提高,活性氧作为信号分子可能参与了对井冈霉素的调节。进一步通过对井冈霉素结构基因的转录及相关酶活进行检测,发现活性氧的诱导能提高井冈霉素结构基因的转录。通过对糖酵解途径的关键酶3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)和戊糖磷酸途径中的关键酶6磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)酶活水平进行检测,结果表明活性氧的诱导能在一定程度上促进代谢流从糖酵解途径向戊糖磷酸途径转变。本实验室前期工作表明温度对井冈霉素产量有重要影响,高温有利于井冈霉素的合成但对细胞生长不利,同时较高的发酵温度能有效促进井冈霉素结构基因的转录。能否通过温度迁移策略进一步提高其发酵产量有待进一步研究。本研究首先在发酵前期30度培养,然后在发酵不同阶段迁移到42度继续发酵。通过优化温度迁移时间,提高了井冈霉素的产量,但并没有提高细胞生长。为考察温度迁移如何促进井冈霉素产量的提高,在温度迁移过程中添加过氧化氢和DPI,同时检测了细胞内活性氧水平的变化。结果显示,42度条件下胞内活性氧水平高于30度,温度迁移促进活性氧水平的提升。DPI的添加能在一定程度上延迟活性氧水平的提升,且对井冈霉素的产量有一定抑制。此结果暗示着活性氧可能参与了在温度对井冈霉素产量的调节。温度对G6PDH酶的比活的影响表明,42度条件下酶的比活比30度还要低,此结果暗示着42度下G6PDH酶的表达量较低。由于温度可以直接影响酶的活力,因此我们分别在30度和42度条件下检测相同样品酶的活力。结果表明,42度下G6PDH酶活力大大提高,表明温度可在表达水平和酶动力学水平上调节G6PDH酶活。通过对压力响应的转录因子sigmaB和sigmaH及全局调控因子phoRP转录水平的分析,暗示着它们可能参与了温度对井冈霉素的调节。综合以上信息,本论文通过统计学方法优化了井冈霉素发酵培养基,通过对两种培养基中细胞生长、产物合成、基因转录和前体代谢相关酶活多水平差异的分析,表明结构基因的表达在井冈霉素发酵生产中有重要作用。通过添加过氧化氢和温度迁移的方法进一步提高了其发酵产量,同时从信号分子、基因转录和酶活水平初步探讨了这些发酵策略的调控机制。这些信息可以为进一步了解井冈霉素的调节机制提供帮助,还为其它抗生素的发酵及代谢操作提供参考。
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