硒元素(Selenium，Se)是一种必须的微量营养元素，与诸多的疾病和生物学过程相关，硒蛋白(selenoprotein)是硒元素在生物体中的主要存在形式。所有含硒代半胱氨酸(SelenoCysteine，Sec，U)的蛋白质均可称为硒蛋白。Sec是Cysteine的类似物，但具有更低的氧化还原电位，因此具有更加活泼的化学性质，由于其对生命活动的重要性，又被称为第21种氨基酸。已知的硒蛋白大多具有氧化还原活性，在生物抗氧化，维持机体氧化还原平衡过程中具有十分重要的意义。目前已知硒蛋白在癌症、心血管疾病以及神经退行性疾病等中扮演重要的角色。Sec由经典的终止密码子UGA所编码。已有的研究表明Sec插入到UGA密码子时需要一个特殊的mRNA二级结构，硒代半胱氨酸插入序列原件(SECIS)。SECIS通常被用于硒蛋白的软件预测，尽管它在不同硒蛋白中、不同物种之间并不具有很高的保守性。硒蛋白具有重要的生物学意义，但目前除了氧化还原活性外，硒蛋白的其他功能还知之甚少。目前为止，人类中只发现了25种硒蛋白，小鼠24种，E.coli3种。这主要是由于基于SECIS预测的硒蛋白研究方法并不总是成功，而且mRNA预测结果并不保证相应的硒蛋白真实表达。为了解决上述难题，建立了一种基于质谱技术的硒蛋白鉴定方法。利用Sec与Cys亲核性差异，建立了在酸性条件下使用biotin卤代烃衍生物对Sec进行特异性标记的硒蛋白富集方法。利用烷基化Sec和Cys的氧化稳定性差异，将Sec特异性转化为Dha，并建立了Dha特异的硒蛋白富集方法。这两种Sec多肽特异的富集方法极大的提高了硒蛋白的检测灵敏度和定量准确性。使用这种方法，在小鼠8个组织和BV2细胞中共鉴定到19个已知硒蛋白，并进行了定量研究。结果显示，硒蛋白在不同在组织间存在极大的表达差异，testis具有最高的硒蛋白表达水平。BV2细胞中不同硒蛋白对Na2SeO3的诱导具有不同的响应。　　二硫键是通过两个半胱氨酸侧链上的巯基相互交联形成的，对蛋白质的折叠、稳定、构象转变和行使功能有着十分重要的意义。目前对二硫键的研究，尤其是在蛋白质组学水平上的研究还很滞后，这主要受限于二硫键本身的复杂性和研究方法的有效性。利用质谱技术在组学水平进行二硫键的鉴定研究已有报导，但都以开发新算法为主。由于算法过于复杂且缺乏有效的二硫键富集手段，这些新方法的鉴定成功率较低，同时新软件易用性较差，难以普及。为了解决上述难题，我们旨在开发一种新的二硫键富集和鉴定技术。羧肽酶X是一种无位点特异性的蛋白外切酶，可从多肽或蛋白的C末端向N末端逐个降解氨基酸。酶切位点氨基酸残基的侧链对羧肽酶X的活性具有重要作用，主要参与酶切反应过程中肽键空间位置的控制，而二硫键交联多肽在Cysteine侧链上引入了巨大的空间位阻，阻碍了羧肽酶X与底物的结合。羧肽酶X能够降解整个线性多肽，但只能降解二硫键交联多肽的羧基端，从而富集二硫键交联多肽。此外经过羧肽酶X处理后的交联多肽变得简单，易于线性化，通过重构蛋白数据库后便可直接使用已有的蛋白组学搜库软件进行谱图解析和二硫键鉴定。按照上述方法，对广泛使用的mascot搜库软件进行了参数优化，编写了数据库重构代码，从12条标准多肽的78种组合形式中单次鉴定到71种，并在IgG标准蛋白中鉴定到了19对二硫键。