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目的:
癫痫作为一种严重的神经系统功能紊乱的慢性疾病，给患者本人、家庭造成极大痛苦，并成为严重的社会负担，癫痫的研究一直是医学研究领域的一个热点。但到目前为止机制尚不清楚。
癫痫的发生与脑内兴奋-抑制神经递质的失衡有关。γ-氨基丁酸(GABA)是脑组织内主要的抑制性神经递质，各种类型癫痫的发生几乎均与脑内GABA的改变有关，无论是脑内GABA表达量、GABA受体表达量以及二者亲和力改变均可影响癫痫的发生。如通过抑制GABA合成酶-谷氨酸脱羧酶减少GABA的合成或是阻断GABA与其受体结合，都能减少GABA对神经元的抑制，而诱发抽搐发生，相反，通过减少GABA降解增加GABA含量或通过变构调节增加GABA与其受体结合，均有抗惊厥的作用。
海人酸(Kainic acid，KA)，即红藻氨酸，为谷氨酸结构类似物，与谷氨酸受体结合，能够产生很强的神经兴奋作用。它与神经元细胞突触后膜的海人酸受体结合，产生兴奋性突触后电流，能诱发动物癫痫发作。应用海人酸海马立体定位注射诱导的癫痫动物模型，可出现癫痫典型的自发性发作，病灶以海马、杏仁核和其它边缘结构为主，病理上出现与颞叶癫痫的海马硬化类似的病变。与人类颞叶癫痫一样，对目前临床应用上的大部分抗癫痫药物耐受。海人酸癫痫模型是研究颞叶癫痫的理想模型。
最新研究表明粘合连接相关蛋白1(AJAP1)与GABA受体密切结合，因此设想其可能通过改变GABA量和/或其受体功能，从而改变GABA功能而影响癫痫的发生发展。本研究旨在发现癫痫发生的关键分子，为癫痫尤其是耐药的难治性癫痫的治疗提供一个新的分子靶标。
本实验分为三个部分，第一部分:AJAP1在难治性颞叶癫痫患者及海人酸动物癫痫模型中的表达，目的:检测AJAP1在难治性颞叶癫痫患者及海人酸诱导的C57BL/6癫痫小鼠模型脑组织中的荧光定位及蛋白表达情况，并培养原代神经元细胞，应用免疫荧光进行AJAP1的亚细胞定位。第二部分:改变AJAP1的表达水平对海人酸动物癫痫模型行为学、在体场电位的影响，目的:为了证实AJAP1确实参与到了癫痫的发生发展中，构建了慢病毒(LV)载体，以转染AJAP1过表达基因和AJAP1-shRNA，通过海马立体定位注射慢病毒，干预AJAP1的表达，观察AJAP1的变化对海人酸诱导的癫痫模型行为学、场电位的影响。第三部分:AJAP1与GABABR1的定位关系以及其相互作用，探讨AJAP1在癫痫发生中作用的可能机制，目的:证实AJAP1通过影响GABABR1受体的量，初步探讨AJAP1对海人酸诱导癫痫动物保护作用的可能的潜在机制。
方法:
第一部分AJAP1在难治性颞叶癫痫患者及动物癫痫模型中的表达
1.本实验获得重庆医科大学第一附属医院神经内科王学峰主任大力支持。王学峰主任课题组收集了300多例难治性颞叶癫痫患者，多种抗癫痫药物联合治疗仍有癫痫发作，经反复评估后，行手术治疗，留取脑组织建立癫痫脑组织标本库，同时收集了既往无神经系统疾病史，因脑外伤行脑叶切除减压患者的颞叶皮质脑标本，建立对照脑标本库。从上述脑标本库中，随机抽取癫痫组16例脑标本，脑外伤对照组16例脑标本。
2.实验涉及的成年雄性C57BL/6小鼠（体重18-22g，6-8周龄）均来自予重庆医科大学动物实验中心，饲养于标准条件，同时严格遵守重庆医科大学实验动物伦理委员会相关规定。将25只小鼠分为两组:癫痫组n=16、对照组n=9。癫痫组应用海马区立体定位注射海人酸，建立癫痫模型，对照组应用同样方法注射同体积生理盐水。置于23±1℃，自然昼夜节律光照，随意获取食物和水的环境下，4周后，根据Racine痫性发作分级标准评分，0级:未见肢体抽搐发作，无显著异常行为;1级:湿狗般抖动，面部可见抽搐如节律性眨眼、动须及咀嚼;2级:肌肉痉挛，可表现为点头或甩尾;3级:仅一侧前肢阵挛;4级:双侧前肢阵挛，伴后肢站立;5级:全身阵挛，失去平衡，跌倒。将发作等级≥4分的设为癫痫组(n=11)。脑立体定位注射生理盐水组，设为对照组(n=9)。一部分小鼠（癫痫组n=8，对照组n=8），断头取脑，立即分离海马、皮层用于免疫印迹，另一部分小鼠（癫痫组n=3，对照组n=1）应用4％多聚甲醛心脏灌注后断头取脑，-80℃冰冻保存后切片，用于免疫荧光。
1.通过上海吉凯公司构建AJAP1的过表达基因和AJAP1-shRNA的慢病毒载体，并以相应未加载基因的空慢病毒作为各自的对照组。
2.成年雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:AJAP1过表达基因慢病毒组（AJAP1-UP）、空过表达慢病毒组(CON-UP)、AJAP1-shRNA慢病毒组(AJAP1-DOWN)、空抑制表达慢病毒组(CON-DOWN)。分组进行相应慢病毒的海马区立体定位注射。标准条件下饲养2周后，每组2只小鼠麻醉后断头取脑，-80℃冰箱冷冻后切片，观察病毒携带绿色荧光蛋白，确定转染小鼠海马区脑组织范围。
3.在所有慢病毒干预的C57BL/6小鼠中，通过立体定位方法，注射海人酸建立癫痫模型，造模后持续视频监测大鼠自发性痫性发作情况，共观察了36天，统计了癫痫动物模型的发作次数，进行分析。
4.行为观察后，将海人酸癫痫动物模型固定在立体定位装置上，去除部分右侧颅骨，将排状微电极植入右侧海马（AP-1.6，ML-1.5，DV-1.5），并用骨水泥将微电极固定在头骨上。随后应用Omniplex(R)D神经数据采集系统(Plexon，Dallas，TX)采集体内局部场电位并记录成脑电图，共计记录30分钟，并通过NeuroExplorer v4.0(Plexon，Dallas，TX)进行分析。高振幅（＞2倍基线）和高频率（＞5赫兹）持续时间超过5秒的记录被认为是一次放电。
第三部分AJAP1在癫痫发生中作用的可能机制
1.建立颞叶癫痫患者脑片、C57BL/6癫痫小鼠海马区脑片、原代神经元细胞爬片，行免疫荧光检测AJAP1和GABABR1的共定位表达。
2.建立成年雄性C57BL/6小鼠癫痫模型，取海马区脑标本，应用免疫共沉淀技术，检测AJAP1与GABABR1的相互作用。
3.如第二部分所述实验小鼠，分组后经海马注射相应的慢病毒，标准饲养条件下喂养2周后，所有小鼠麻醉后断头取脑，留取海马区脑标本，应用免疫印迹方法检测各组GABABR1受体的表达变化情况，应用PCR技术检测GABABR1转录水平变化。
结果:
1.免疫荧光结果显示，在人癫痫脑组织中AJAP1仅表达于神经元细胞，而不表达于神经胶质细胞。这一结果在癫痫小鼠中也得到验证。在新生C57BL/6小鼠原代神经元中，AJAP1广泛表达于兴奋性神经元突触前膜、突触后膜以及抑制性神经元突触前膜、突触后膜。
2.在癫痫组及对照组人脑标本中AJAP1均有表达，且难治性癫痫患者脑组织中AJAP1的表达量与对照组相比显著降低（**p＜0.01）。
3.在海人酸癫痫模型组中，小鼠皮层和海马中AJAP1的表达水平显著低于对照组（分别**p＜0.01，*p＜0.05）。
4.4组慢病毒海马立体定位注射后2周，病毒自带绿色荧光蛋白清楚显示病毒感染海马区范围。并应用免疫印迹实验证实AJAP1慢病毒可达到干预AJAP1表达目的。
5.慢病毒干预后，应用海人酸注射建立的癫痫模型中，与相应对照组相比，AJAP1过表达组发作次数显著减少，而AJAP1抑制表达组的发作次数则明显增加。
6.干预AJAP1表达后建立的癫痫动物模型的体内局部场电位比较分析显示，AJAP1过表达组癫痫小鼠脑电发放频率及放电时长均与对照组相比明显下降，而在AJAP1抑制表达组则有相反的结论。
7.免疫荧光结果显示，在人癫痫脑组织、C57BL/6小鼠癫痫模型脑组织、C57BL/6小鼠原代神经元中AJAP1与GABABR1均有共定位表达。
8.免疫共沉淀结果显示AJAP1与GABABR1有相互结合。
结论:
1.AJAP1广泛表达于脑内神经元细胞，包括兴奋性神经元突触前后膜、抑制性神经元突触前后膜。
2.在难治性癫痫患者及海人酸癫痫模型的脑组织中AJAP1表达含量与对照组相比均有显著的下降，提示AJAP1可能在癫痫的发生发展中起到作用。
3.慢病毒转染AJAP1过表达基因和AJAP1-shRNA，通过海马区立体定位注射，能够成功转染海马区，并在观察完场电位的小鼠海马区显著改变AJAP1的表达含量。
4.上调AJAP1的表达能够显著减少海人酸诱导的癫痫动物模型的痫性发作次数，而下调AJAP1的表达，能产生相反的结果。这一结论在癫痫动物模型的脑电图结果中得到再次验证。充分说明AJAP1参与到了癫痫的发病机制中。
5.AJAP1与GABABR1有共定位并相互结合，上调AJAP1后GABABR1的表达含量增加，下调AJAP1后有相反的结论。调整AJAP1表达后，并未影响GABABR1转录水平变化。
6.据以上实验结论，考虑AJAP1是通过增加GABABR1的表达来影响癫痫的发作。可将AJAP1定义为癫痫的保护性蛋白分子，为癫痫治疗提供一个新的思路。
癫痫作为一种严重的神经系统功能紊乱的慢性疾病，给患者本人、家庭造成极大痛苦，并成为严重的社会负担，癫痫的研究一直是医学研究领域的一个热点。但到目前为止机制尚不清楚。
癫痫的发生与脑内兴奋-抑制神经递质的失衡有关。γ-氨基丁酸(GABA)是脑组织内主要的抑制性神经递质，各种类型癫痫的发生几乎均与脑内GABA的改变有关，无论是脑内GABA表达量、GABA受体表达量以及二者亲和力改变均可影响癫痫的发生。如通过抑制GABA合成酶-谷氨酸脱羧酶减少GABA的合成或是阻断GABA与其受体结合，都能减少GABA对神经元的抑制，而诱发抽搐发生，相反，通过减少GABA降解增加GABA含量或通过变构调节增加GABA与其受体结合，均有抗惊厥的作用。
海人酸(Kainic acid，KA)，即红藻氨酸，为谷氨酸结构类似物，与谷氨酸受体结合，能够产生很强的神经兴奋作用。它与神经元细胞突触后膜的海人酸受体结合，产生兴奋性突触后电流，能诱发动物癫痫发作。应用海人酸海马立体定位注射诱导的癫痫动物模型，可出现癫痫典型的自发性发作，病灶以海马、杏仁核和其它边缘结构为主，病理上出现与颞叶癫痫的海马硬化类似的病变。与人类颞叶癫痫一样，对目前临床应用上的大部分抗癫痫药物耐受。海人酸癫痫模型是研究颞叶癫痫的理想模型。
最新研究表明粘合连接相关蛋白1(AJAP1)与GABA受体密切结合，因此设想其可能通过改变GABA量和/或其受体功能，从而改变GABA功能而影响癫痫的发生发展。本研究旨在发现癫痫发生的关键分子，为癫痫尤其是耐药的难治性癫痫的治疗提供一个新的分子靶标。
本实验分为三个部分，第一部分:AJAP1在难治性颞叶癫痫患者及海人酸动物癫痫模型中的表达，目的:检测AJAP1在难治性颞叶癫痫患者及海人酸诱导的C57BL/6癫痫小鼠模型脑组织中的荧光定位及蛋白表达情况，并培养原代神经元细胞，应用免疫荧光进行AJAP1的亚细胞定位。第二部分:改变AJAP1的表达水平对海人酸动物癫痫模型行为学、在体场电位的影响，目的:为了证实AJAP1确实参与到了癫痫的发生发展中，构建了慢病毒(LV)载体，以转染AJAP1过表达基因和AJAP1-shRNA，通过海马立体定位注射慢病毒，干预AJAP1的表达，观察AJAP1的变化对海人酸诱导的癫痫模型行为学、场电位的影响。第三部分:AJAP1与GABABR1的定位关系以及其相互作用，探讨AJAP1在癫痫发生中作用的可能机制，目的:证实AJAP1通过影响GABABR1受体的量，初步探讨AJAP1对海人酸诱导癫痫动物保护作用的可能的潜在机制。
方法:
第一部分AJAP1在难治性颞叶癫痫患者及动物癫痫模型中的表达
1.本实验获得重庆医科大学第一附属医院神经内科王学峰主任大力支持。王学峰主任课题组收集了300多例难治性颞叶癫痫患者，多种抗癫痫药物联合治疗仍有癫痫发作，经反复评估后，行手术治疗，留取脑组织建立癫痫脑组织标本库，同时收集了既往无神经系统疾病史，因脑外伤行脑叶切除减压患者的颞叶皮质脑标本，建立对照脑标本库。从上述脑标本库中，随机抽取癫痫组16例脑标本，脑外伤对照组16例脑标本。
2.实验涉及的成年雄性C57BL/6小鼠（体重18-22g，6-8周龄）均来自予重庆医科大学动物实验中心，饲养于标准条件，同时严格遵守重庆医科大学实验动物伦理委员会相关规定。将25只小鼠分为两组:癫痫组n=16、对照组n=9。癫痫组应用海马区立体定位注射海人酸，建立癫痫模型，对照组应用同样方法注射同体积生理盐水。置于23±1℃，自然昼夜节律光照，随意获取食物和水的环境下，4周后，根据Racine痫性发作分级标准评分，0级:未见肢体抽搐发作，无显著异常行为;1级:湿狗般抖动，面部可见抽搐如节律性眨眼、动须及咀嚼;2级:肌肉痉挛，可表现为点头或甩尾;3级:仅一侧前肢阵挛;4级:双侧前肢阵挛，伴后肢站立;5级:全身阵挛，失去平衡，跌倒。将发作等级≥4分的设为癫痫组(n=11)。脑立体定位注射生理盐水组，设为对照组(n=9)。一部分小鼠（癫痫组n=8，对照组n=8），断头取脑，立即分离海马、皮层用于免疫印迹，另一部分小鼠（癫痫组n=3，对照组n=1）应用4％多聚甲醛心脏灌注后断头取脑，-80℃冰冻保存后切片，用于免疫荧光。
1.通过上海吉凯公司构建AJAP1的过表达基因和AJAP1-shRNA的慢病毒载体，并以相应未加载基因的空慢病毒作为各自的对照组。
2.成年雄性C57BL/6小鼠随机分为4组:AJAP1过表达基因慢病毒组（AJAP1-UP）、空过表达慢病毒组(CON-UP)、AJAP1-shRNA慢病毒组(AJAP1-DOWN)、空抑制表达慢病毒组(CON-DOWN)。分组进行相应慢病毒的海马区立体定位注射。标准条件下饲养2周后，每组2只小鼠麻醉后断头取脑，-80℃冰箱冷冻后切片，观察病毒携带绿色荧光蛋白，确定转染小鼠海马区脑组织范围。
3.在所有慢病毒干预的C57BL/6小鼠中，通过立体定位方法，注射海人酸建立癫痫模型，造模后持续视频监测大鼠自发性痫性发作情况，共观察了36天，统计了癫痫动物模型的发作次数，进行分析。
4.行为观察后，将海人酸癫痫动物模型固定在立体定位装置上，去除部分右侧颅骨，将排状微电极植入右侧海马（AP-1.6，ML-1.5，DV-1.5），并用骨水泥将微电极固定在头骨上。随后应用Omniplex(R)D神经数据采集系统(Plexon，Dallas，TX)采集体内局部场电位并记录成脑电图，共计记录30分钟，并通过NeuroExplorer v4.0(Plexon，Dallas，TX)进行分析。高振幅（＞2倍基线）和高频率（＞5赫兹）持续时间超过5秒的记录被认为是一次放电。
第三部分AJAP1在癫痫发生中作用的可能机制
1.建立颞叶癫痫患者脑片、C57BL/6癫痫小鼠海马区脑片、原代神经元细胞爬片，行免疫荧光检测AJAP1和GABABR1的共定位表达。
2.建立成年雄性C57BL/6小鼠癫痫模型，取海马区脑标本，应用免疫共沉淀技术，检测AJAP1与GABABR1的相互作用。
3.如第二部分所述实验小鼠，分组后经海马注射相应的慢病毒，标准饲养条件下喂养2周后，所有小鼠麻醉后断头取脑，留取海马区脑标本，应用免疫印迹方法检测各组GABABR1受体的表达变化情况，应用PCR技术检测GABABR1转录水平变化。
结果:
1.免疫荧光结果显示，在人癫痫脑组织中AJAP1仅表达于神经元细胞，而不表达于神经胶质细胞。这一结果在癫痫小鼠中也得到验证。在新生C57BL/6小鼠原代神经元中，AJAP1广泛表达于兴奋性神经元突触前膜、突触后膜以及抑制性神经元突触前膜、突触后膜。
2.在癫痫组及对照组人脑标本中AJAP1均有表达，且难治性癫痫患者脑组织中AJAP1的表达量与对照组相比显著降低（**p＜0.01）。
3.在海人酸癫痫模型组中，小鼠皮层和海马中AJAP1的表达水平显著低于对照组（分别**p＜0.01，*p＜0.05）。
4.4组慢病毒海马立体定位注射后2周，病毒自带绿色荧光蛋白清楚显示病毒感染海马区范围。并应用免疫印迹实验证实AJAP1慢病毒可达到干预AJAP1表达目的。
5.慢病毒干预后，应用海人酸注射建立的癫痫模型中，与相应对照组相比，AJAP1过表达组发作次数显著减少，而AJAP1抑制表达组的发作次数则明显增加。
6.干预AJAP1表达后建立的癫痫动物模型的体内局部场电位比较分析显示，AJAP1过表达组癫痫小鼠脑电发放频率及放电时长均与对照组相比明显下降，而在AJAP1抑制表达组则有相反的结论。
7.免疫荧光结果显示，在人癫痫脑组织、C57BL/6小鼠癫痫模型脑组织、C57BL/6小鼠原代神经元中AJAP1与GABABR1均有共定位表达。
8.免疫共沉淀结果显示AJAP1与GABABR1有相互结合。
结论:
1.AJAP1广泛表达于脑内神经元细胞，包括兴奋性神经元突触前后膜、抑制性神经元突触前后膜。
2.在难治性癫痫患者及海人酸癫痫模型的脑组织中AJAP1表达含量与对照组相比均有显著的下降，提示AJAP1可能在癫痫的发生发展中起到作用。
3.慢病毒转染AJAP1过表达基因和AJAP1-shRNA，通过海马区立体定位注射，能够成功转染海马区，并在观察完场电位的小鼠海马区显著改变AJAP1的表达含量。
4.上调AJAP1的表达能够显著减少海人酸诱导的癫痫动物模型的痫性发作次数，而下调AJAP1的表达，能产生相反的结果。这一结论在癫痫动物模型的脑电图结果中得到再次验证。充分说明AJAP1参与到了癫痫的发病机制中。
5.AJAP1与GABABR1有共定位并相互结合，上调AJAP1后GABABR1的表达含量增加，下调AJAP1后有相反的结论。调整AJAP1表达后，并未影响GABABR1转录水平变化。
6.据以上实验结论，考虑AJAP1是通过增加GABABR1的表达来影响癫痫的发作。可将AJAP1定义为癫痫的保护性蛋白分子，为癫痫治疗提供一个新的思路。