目的克隆、表达、鉴定结核分枝杆菌Rv0091、Rv0535基因编码蛋白,建立酶活性检测方法,分析酶生化特性及活性位点,为进行晶体结构分析和活性位点鉴定奠定基础。方法构建Rv0091、Rv0535基因原核表达质粒；在大肠杆菌BL21trxB进行表达,经IPTG诱导,Ni2+-NTA柱纯化后获得可溶性蛋白；通过SDS-PAGE分析目的蛋白纯度、Western blot进行免疫学活性鉴定、质谱分析重组蛋白分子质量、酶偶联法检测酶活性,分析酶学性质；利用同源模建的方法,获得重组蛋白的三维模拟结构模型,通过序列及结构比对,推测酶活性位点。结果成功构建Rv0091、Rv0535基因原核表达质粒,建立了可溶性蛋白最佳表达体系,获得纯度在95%以上的可溶性蛋白,Western blot结果证实重组蛋白为结核分枝杆菌蛋白,质谱鉴定其相对分子量与理论分子量基本一致,酶学活性实验证实重组蛋白能够分解底物MTA,酶学性质分析表明最适缓冲液为磷酸盐缓冲液和Hepes,酶的热稳定性较差,37℃为最适反应温度,最适pH为8-10。根据同源模建和序列比对结果,识别出11个残基为MTAN与底物的活性结合位点,14个残基为MTAP与底物的活性结合位点。结论本研究论文完成了结核分枝杆菌MTAN、MTAP的克隆、表达和纯化,并建立了酶学活性检测方法,同时,进一步通过同源模建方法获得了酶与FMA、MTA复合物的结构模型,并结合序列比对,推导出序列中的活性结合位点。这些工作的开展,为基于结构的先导化合物设计和筛选奠定了扎实的基础。