稻瘟病菌(Magnaporthegrisea，无性态：Pyriculariagrisea)引起的水稻稻瘟病，是水稻生产上最具毁灭性的病害之一。通过实践证明，控制该病害最为有效的途径是选育和利用抗病品种。另一方面，已知水稻抗病基因与稻瘟病菌无毒基因之间的特异性互作符合“基因对基因”学说，即二者相互作用才能导致水稻表现抗病反应。因此，稻瘟病菌无毒基因的克隆及其功能研究与抗病基因一样，具有重要意义。 为了快速地定位和克隆一个新的稻瘟病菌无毒基因AvrPi39，本研究主要进行了以下4个方面的工作。 1无毒基因AvrPi39的遗传分析 为了发掘和鉴定稻瘟病菌无毒基因，选择了携带稻瘟病抗病基因Pi39的水稻品种Q15，对2个田间菌株CHL42(非致病性)和CHL43(致病性)及其有性杂交的212个子囊孢子菌株进行了致病性分析。结果表明，这212个子囊孢子菌株的非致病与致病反应符合1∶1的分离比(x2=3.44，P＜0.05)。由此推断，菌株CHL42携带一个无毒基因AvrPi39。 2AvrPi39的遗传及物理作图 利用分离群体分析法(bulked-segregantanalysis，BSA)，从分布于稻瘟病菌7条染色体上的121个SSR标记中，筛选到了6个位于第1染色体的连锁候选标记。并进一步利用212个后代子囊孢子进行连锁分析，从而快速地把无毒基因AvrPi39定位到第1染色体上靠近端粒2(TEL2)的区域。 为了精细定位该无毒基因，利用测序菌株70-15的参考序列，在目的基因区域开发了¨个SSR标记和4个候选无毒基因(candidateavirulencegene，CAG)标记，其中4个SSR标记和2个CAG标记在亲本之间检测到了多态性。通过对212个子囊孢子菌株进行连锁分析，进一步把该无毒基因AvrPi39精细定位到TEL2上1.2cM的区域。 最后，通过生物信息学分析法(bioinformaticsanalysis，BIA)，利用参考菌株70-15的序列，构建了该无毒基因的电子物理图谱，从而把该无毒基因界定到了11.2kb的区段内。 3AvrPi39候选基因的克隆及序列分析 为了克隆无毒基因AvrPi39，以菌株70-15的参考序列作为参考，利用基因预测软件SofiberryFGENESH(http：//www.sofiberry.com)，对目的基因区域进行了基因预测，初步确定了3个候选基因，并分别命名为LA1，LA2和LA3。于是，利用长片段PCR及双元载体克隆技术，对这3个候选基因进行了克隆。由于LA2的扩增是非特异性的，因此，用另外设计的引物对LA2进行克隆，并改命名为LA5。把克隆的各个候选基因进行了测序。并进行了拼接，然后与70-15的参考序列进行了比对分析，结果发现，LA1由于缺失以不再是一个完整的基因；而LA3由于片段的插入变为了两个基因；LA5则还是一个完整的基因。 4AvrPi39候选基因的遗传转化 为最终分离目的基因，以致病性亲本菌株CHLA3为受体菌株，将含有候选无毒基因的LA3和LA5的克隆通过根癌农杆菌介导的转化体系分别进行了遗传转化，获得了一批转化子菌株。这些转化子菌株的致病性鉴定，从而初步证明了LA3的克隆中含有无毒基因AvrPi39。