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目的:1.研究EGFL6在食管癌患者中的表达情况及与临床病理资料之间的联系;2.研究EGFL6沉默时对食管癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响;3.研究EGFL6过表达时对食管癌细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响;4.探究EGFL6诱导食管癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制。方法:1.收集山西医科大学第一医院2017-2019年食管癌患者的癌组织及癌旁组织,通过免疫组织化学染色的方法比较EGFL6在不同的组织中的表达情况,结合食管癌患者的临床病理资料,分析EGFL6表达水平与临床病理资料及生存率的相关性,并利用TCGA(The Cancer Genome Atlas)数据库检测EGFL6基因在人类食管癌组织中的表达水平;2.通过Real-time PCR和Western-blot法检测EGFL6在正常的食管上皮细胞系(Het-1A)和不同食管癌细胞系(EC9706、KYSE150、KYSE450)中的表达情况;3.以EGFL6基因表达量较高的KYSE450细胞系和表达量较低的KYSE150细胞系为研究对象,通过分别转染EGFL6小干扰RNA和过表达质粒,构建EGFL6基因沉默和过表达的食管癌细胞系,将KYSE450细胞分成3组:空白组(blank)、对照组(siNC)和小干扰组(siRNA);将KYSE150细胞分成2组:空质粒组(PcDNA3.1)和EGFL6过表达组(PcDNA3.1+EGFL6),通过Real-time PCR和Western-blot法检测转染效率;4.通过CCK8实验和平板克隆形成实验检测EGFL6沉默和过表达时对食管癌细胞增殖的影响;5.通过细胞划痕实验和transwell实验检测当EGFL6沉默和过表达时对食管癌细胞的侵袭迁移的影响;6.通过流式细胞术检测EGFL6对食管癌细胞凋亡影响,应用Real-time PCR和Western-blot法检测凋亡相关标志(Bcl-2、Bax和Casepase3)的变化;7.通过Real-time PCR和Western-blot法检测食管癌细胞中EGFL6沉默和过表达时对EMT相关标志物(E-cadherin、Vimentin、Snail、Fibronectin、Twist和N-cadherin)的影响;8.通过Real-time PCR检测食管癌细胞中EGFL6沉默和过表达时对食管癌相关干细胞标记物(Bmi1、OCT、SOX2、NANOG、CD44)影响;9.通过Western-blot法检测EGFL6对Wnt/β-catenin信号通路中关键蛋白(p-β-catenin、β-catenin、GSK3β、c-myc)表达水平的影响;10.动物实验:裸鼠皮下注射shEGFL6-KYSE450组和shNC-KYSE450组细胞,构建裸鼠食管癌移植瘤模型,测量移植瘤的体积和质量并进行统计学分析。结果:1.EGFL6蛋白在食管癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织;EGFL6蛋白的表达水平与食管癌患者肿瘤的大小(P=0.042)、T分类(P=0.014)、淋巴结的转移(P=0.002)、远处转移(P<0.001)、癌分化程度(P=0.01)有关,与患者年龄(P=0.541)、性别(P=0.496)无关;TCGA数据库显示EGFL6基因在人食管癌组织中的表达水平明显高于癌旁,EGFL6蛋白表达高的食管癌患者的总体生存率低于EGFL6蛋白表达低的患者(P<0.05);2.EGFL6在食管上皮细胞(Het-1A)中的表达明显低于食管癌细胞(EC9706、KYSE150、KYSE450),且EGFL6在KYSE450细胞系中表达最高,在KYSE150细胞系中表达相对较低;3.CCK-8实验显示,当EGFL6基因沉默时,相对于对照组,食管癌细胞活力明显降低;当EGFL6基因过表达时,相对于对照组,食管癌细胞活力明显增强;4.平板克隆形成实验显示,当EGFL6基因沉默时,相对于对照组,食管癌细胞形成的克隆团块明显少;当EGFL6基因过表达时,相对于对照组,食管癌细胞形成的克隆团块明显增多;5.细胞划痕实验和transwell实验显示,当EGFL6基因沉默时,相对于对照组,食管癌细胞的侵袭迁移能力明显降低;当EGFL6基因过表达时,相对于对照组,食管癌细胞的侵袭迁移能力明显增强;6.流式细胞术显示EGFL6沉默时食管癌细胞凋亡明显增加,EGFL6过表达时食管癌细胞的凋亡明显减少,Real-time PCR和Western-blot结果与流式一致;7.Real-time PCR和Western-blot检测EMT相关标志物发现:EGFL6沉默时抑制食管癌细胞向EMT方向转变,EMT相关标志物E-cadherin表达增高;Vimentin、Snail、Fibronectin、Twist和N-cadherin表达降低;EGFL6过表达时促进食管癌细胞向EMT方向转变,EMT相关标志物E-cadherin表达降低;Vimentin、Snail、Fibronectin、Twist和N-cadherin表达增高;8.Real-time PCR检测食管癌干细胞相关基因在EGFL6基因沉默和过表达时的表达情况,结果显示当EGFL6基因沉默时,食管癌干细胞基因表达较低;当EGFL6基因过表达时,食管癌干细胞基因表达增高,说明EGFL6可能参与维持食管癌干细胞样细胞群的表达;9.Western-blot检测Wnt/β-catenin信号的标记基因p-β-catenin、β-catenin、GSK3β和c-myc的表达。结果表明在KYSE450细胞中,相对于siNC组,siRNA组p-β-catenin、总β-catenin和c-myc蛋白表达下调,GSK3β蛋白表达上调;在KYSE150细胞中,相对于PcDNA3.1组,PcDNA3.1+EGFL6组中p-β-catenin、总β-catenin和c-myc蛋白表达上调,GSK3β蛋白表达下降;10.裸鼠皮下移植瘤模型构建成功,相对于shNC-KYSE450组,shEGFL6-KYSE450组裸鼠皮下形成的肿瘤体积明显减小,质量明显降低,这与我们在细胞实验上的结果一致。结论:1.EGFL6在食管癌组织的表达明显高于癌旁,且与患者的预后不良相关。2.EGFL6能够促进食管癌细胞的增殖、侵袭和迁移,抑制食管癌细胞凋亡。3.EGFL6可能通过Wnt/β-catenin信号通路促进食管癌细胞的EMT的发生和维持食管癌干细胞特性。4.食管癌细胞中敲除EGFL6能够抑制裸鼠皮下移植瘤生长。