【背景】内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacterium,GNB)细胞壁的主要成分,它不仅是决定GNB感染(如脓毒症和感染性休克)的主要致病因子,而且与人类其他许多疾病关系密切,是一种危及人类健康乃至生命的最为重要的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是内毒素的有效成分,由亲水性的多糖(O-特异性多糖,核心多糖)和疏水性的类脂A(Lipid A)组成。其中Lipid A与LPS的毒性相关。LPS在细菌死亡破裂或人工方法裂解后释放,一旦进入人或其他敏感动物体内,将对宿主各系统、器官均可产生广泛的影响。内毒素的致病机制其主要是LPS通过持续刺激机体单核巨噬细胞系统,使之产生大量的细胞因子(如TNF-α、IL-6和IL-12等)、活性氧、溶酶体酶和NO等活性物质,从而引起细胞损伤和凋亡,最终导致失控性炎性反应,并伴有较高的机体死亡率。尽管对内毒素致炎反应的分子机制已经有很多研究,但仍存在着许多未解之谜。因此寻找新的内毒素应答分子,研究相关分子的功能,将会有助于我们更加深入的了解内毒素的作用机制。环境内毒素应答新分子,又名lrp,是一种LPS应答基因,系本课题采用基于PCR的改良消减杂交技术,构建LPS刺激后人牙髓细胞差异表达基因文库,从中筛选出的新基因(GenBank录入号为AF143740),当时得到的只是基因编码N-端186个氨基酸的部分。随后全长cDNA也被克隆并录入GenBank(录入号NM018360)。生物信息学分析表明,全长人lrp(hlrp)基因的开放读框为1584 bp,编码528个氨基酸,编码序列中包含2个相互重叠的亮氨酸拉链结构和1个螺旋-转角-螺旋结构。该分子可能具有重要的作用。在即往研究中,本课题组成功克隆了全长lrp基因后并制备了兔抗lrp多克隆抗体、并进行了Hlrp蛋白在细胞中的定位等相关研究。但对其功能及其表达机制的研究尚未进行。因此本实验将对全长hlrp分子在组织和细胞的表达谱进行初步分析并对其功能做初步的探索。【目的】1.观察Hlrp蛋白在多种正常组织的表达及分布;2.观察分析hlrp分子在不同细胞的表达情况并进行相对定量;3.观察高表达hlrp分子对细胞生长和细胞周期的影响;4.观察针对hlrp分子的特异性RNA干涉对HEK293的生长和细胞周期的影响;5.研究相关脂多糖信号传导分子在高表达hlrp的HEK293细胞与正常HEK293细胞的差异表达。【方法】1.应用正常人体组织芯片(48例不同部位),进行Hlrp免疫组织化学染色;2.采用免疫荧光细胞化学染色,在激光扫描共聚焦显微镜下观察HLrp蛋白在不同细胞系HepG2,HeLa,PDC和HEK293中的表达情况;利用实时定量RT-PCR方法,量化比较hlrp基因在不同细胞系中的表达;3.稳定转染pcDNA3.1(+)-hlrp到HEK293细胞,利用Western Blot技术检测转染后Hlrp蛋白的表达变化,利用MTT法检测转染后细胞增殖活性,用流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化;4.针对Hlrp分子,实施特异性的RNA干涉,利用Western Blot技术检测干涉后Hlrp蛋白的变化,利用MTT法检测干涉后细胞增殖活性,利用流式细胞仪检测干涉后细胞周期的变化;5.应用基因芯片技术检测过表达Hlrp的HEK293细胞与正常HEK293细胞中LPS信号通路相关基因的表达差异性。【结果】1. Hlrp蛋白分布于绝大多数所检测的人体正常组织;2.运用激光扫描共聚焦显微镜可以观察到Hlrp蛋白在所用4种细胞系中均有表达。实时定量RT-RCR结果表明,hlrp分子在HEK293细胞株和PDC细胞株中高表达,并且在PDC细胞株表达高于HEK293细胞株。在HepG2,HeLa细胞株未检测到表达;3.转染pcDNA3.1(+)-hlrp到HEK293细胞后,MTT结果显示转染后细胞的增殖活性与对照组相比明显降低,流式细胞仪检测显示实验组G1期部分阻滞;4.特异性RNA干涉后HEK293细胞Hlrp蛋白水平表达明显下调,干涉后细胞的增殖活性与对照组相比明显增加,流式细胞仪检测显示实验组G1期比例期减少;5.基因芯片检测结果表明:①MAPKs级联通路中,差异表达的基因有12种,其中上调的有6种,下调的有6种;②MAPKs信号通路中差异表达的基因有38种;其中上调14种,下调24种;③TNF-α/NF-κB相关通路中差异表达的基因有58种,其中上调29种,下调29种。【结论】1. Hlrp在多种人体正常组织及培养细胞系中有表达,可为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础;2.获得稳定高表达hlrp的HEK293细胞模型。为今后此类研究提供了理想的细胞平台。3.获得特异干涉hlrp的HEK293细胞模型,此模型可供今后进一步研究;4.稳定高表达的hlrp可产生HEK293细胞G1期部分阻滞;而RNA干涉之后G1期所占比例减少,表明hlrp有可能参与了细胞周期的调节;5.筛选出高表达hlrp的HEK293细胞LPS信号转导通路差异表达基因,可为进一步研究LPS信号转导通路奠定基础。