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1.目的通过随机对照临床试验,验证参地颗粒对慢性肾小球肾炎(Chronic Glomerulonephritis,CGN)脾肾亏虚证患者的临床疗效,并观察CGN患者PD-1/PD-L1共刺激信号通路关键分子的表达,及参地颗粒的干预作用。2.方法采用随机对照临床试验,纳入60例CGN脾肾亏虚证患者,随机分为:缬沙坦组(n=20)、参地颗粒组(n=20)、参地颗粒+缬沙坦组(n=20)。其中,缬沙坦组:予以缬沙坦,每日1次(晨服),每次80mg;参地颗粒组给予参地颗粒,每次1包(10g/包),每日3次,温水冲服;参地颗粒+缬沙坦组给予参地颗粒,每次1包,每日3次,温水冲服,并同时予以缬沙坦,每日1次(晨服),每次80mg;三组均进行12周治疗。取各组人群外周血标本和尿标本,用于检测各组患者药物干预前后的24h尿蛋白定量(24h Upro)、ACR、TCR、肾功能(Scr、BUN、e GFR)及PBMC中PD-1和PD-L1的表达水平、CD4+和CD8+T细胞表达水平;正常组(来自安徽省中医院体检中心)取外周血标本,用于检测PBMC中PD-1和PD-L1的活性、CD4+和CD8+T细胞表达水平作为对照。此外,收集膜性肾病13例、局灶性节段性肾小球硬化7例、微小病变9例、系膜增生性肾小球肾炎7例、结节性糖尿病肾病2例、狼疮性肾炎1例、正常人1例(左肾错构瘤大部分切术患者肾组织),用于检测肾脏组织中PD-1、PD-L1、CD4+、CD8+、CD68表达。3.结果3.1中医证候积分的比较:缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组,各组内患者治疗前与治疗后比较,均有不同程度的下降(P<0.05);各组治疗后,组间两两比较结果显示:参地颗粒+缬沙坦组与参地颗粒组间未见显著性差异(P>0.05),参地颗粒组优于缬沙坦组(P<0.05)。3.2中医证候疗效比较:缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组总有效率分别为75%、90%、90%。参地颗粒组与缬沙坦组比较差异有统计学意义(P<0.05);参地颗粒组与参地颗粒+缬沙坦组比较未见显著性差异(P>0.05);缬沙坦组、参地颗粒+缬沙坦组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.3疾病疗效比较:治疗过程中缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组的总有效率分别为60%、75%、90%。参地颗粒组与缬沙坦组比较差异有统计学意义(P<0.05);参地颗粒组与参地颗粒+缬沙坦组比较差异有统计学意义(P<0.05);缬沙坦组、参地颗粒+缬沙坦组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.4 24h Upro、ACR、TCR比较:与治疗前比较,第4周、第8周、第12周各组患者24h Upro、ACR、TCR比较均具有显著性差异(P<0.05),且疗效具有时间依赖性。各组组间比较,各组治疗前、治疗第4周组间比较,患者24h Upro、ACR、TCR均未见明显差异(P>0.05);治疗第8周、第12周,同时间点均表现为参地颗粒+缬沙坦组疗效优于参地颗粒组(P<0.05),参地颗粒组优于缬沙坦组(P<0.05)。3.5 PBMC中PD-1、PD-L1表达水平:与正常组比较,治疗前缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组患者PBMC中PD-1、PD-L1表达水平均升高,且具有统计学差异(P<0.05);治疗前缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组组间比较,患者PBMC中PD-1、PD-L1统计学无差异(P>0.05)。与治疗前相比,治疗后缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组患者PBMC中PD-1、PD-L1表达均下调,参地颗粒组与缬沙坦组比较差异有统计学意义(P<0.05),参地颗粒组与参地颗粒+缬沙坦组比较差异有统计学意义(P<0.05),缬沙坦组与参地颗粒+缬沙坦组比较差异有统计学意义(P<0.05)。3.6 PBMC中CD4+、CD8+T细胞表达水平及CD4+/CD8+比值情况:与正常组比较,治疗前缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组患者PBMC中CD4+T细胞表达水平下降、CD8+T细胞表达水平上升、CD4+/CD8+比值下降,均具有统计学差异(P<0.05);治疗前缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组组间比较,患者PBMC中CD4+T细胞表达水平、CD8+T细胞表达水平及CD4+/CD8+比值均无统计学无差异(P>0.05)。与治疗前相比,治疗后缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组患者PBMC中CD4+T细胞表达水平升高、CD8+T细胞表达水平下降、CD4+/CD8+比值升高,参地颗粒+缬沙坦组疗效优于参地颗粒组(P<0.05),参地颗粒组的疗效优于缬沙坦组(P<0.05)。3.7肾组织中PD-1、PD-L1、CD4+、CD8+、CD68蛋白表达:免疫荧光与Western blot检测PD-1、PD-L1、CD4+、CD8+、CD68蛋白表达结果一致,各蛋白在正常及各病理类型肾组织中均有表达;其中PD-1、PD-L1、CD8+、CD68在正常人肾组织表达最低,在结节性糖尿病肾病表达最高;CD4+在正常人肾组织中表达最高,而在结节性糖尿病肾病表达最低。3.8肾功能:缬沙坦组、参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组各组的组内和组间比较,肾功能指标(Scr、e GFR、BUN)均有所改善,但在正常范围内。3.9安全性指标:参地颗粒组、参地颗粒+缬沙坦组患者治疗前后安全性指标未见显著变化,期间未见药物不良反应。4.结论4.1参地颗粒治疗CGN脾肾亏虚证患者的疗效显著,能有效改善患者的临床症状,降低尿蛋白水平,参地颗粒+缬沙坦疗效最为显著,其次为参地颗粒、缬沙坦。4.2 CGN脾肾亏虚证患者PBMC中,CD4+T表达下调,CD8+T表达上调,且共刺激信号通路PD-1/PD-L1关键分子呈阳性表达;参地颗粒可能通过下调共激信号通路PD-1/PD-L1中PD-1和PD-L1的表达,进而调整CD4+、CD8+T的活性,维持适度的免疫功能,改善患者的的免疫炎症反应。4.3不同病理类型的肾小球疾病,与正常人相比,其PD-1、PD-L1、CD8+、CD68的表达其均显著上升,在原发肾小球疾病中,系膜增生性肾小球肾炎表达最低,微小病变表达最高;继发肾小球疾病中,狼疮性肾炎表达最低,结节性糖尿病肾病表达最高;与正常人相比,CD4+表达降低,在原发肾小球疾病中,系膜增生性肾小球肾炎表达最高,微小病变表达最低;继发肾小球疾病中,狼疮性肾炎表达最高,结节性糖尿病肾病表达最低。1.目的通过复制系膜增生性肾小球肾炎(Ms PGN)大鼠模型,观察各组大鼠肾组织病理变化,PBMC中CD4+、CD8+T细胞表达水平及肾组织中PD-1、PD-L1蛋白的表达情况,探讨参地颗粒调控共刺激信号分子PD-1/PD-L1通路干预CGN免疫失衡的机制。2.方法选用2月龄雄性清洁级SD大鼠40只,体重200±20g,经一周适应性饲养后,将其随机分为4组:正常组、模型组、参地颗粒组、缬沙坦组,每组各10只。除正常组外,其余各组大鼠均采用尾静脉注射Thy-1抗体,复制Ms PGN大鼠模型。于抗体注射4周后,参地颗粒组给与参地颗粒水溶液(4.0g/kg·d)灌胃,缬沙坦组给予缬沙坦胶囊混悬液(20mg/kg·d)灌胃,其余各组给与等体积生理盐水灌胃,连续给药12周,代谢笼收集大鼠24h尿液。给药结束后,心脏取血,用于检测PBMC中CD4+、CD8+T细胞表达水平;取大鼠肾组织,用于检测PD-1、PD-L1蛋白的表达及观察肾脏组织病理学变化。3.结果3.1正常组大鼠精神状态佳,饮食饮水正常,毛发光泽;其余各组造模后精神状态差,饮食饮水量减少,毛发枯焦。参地颗粒组以及缬沙坦组大鼠给药后,大鼠精神、饮食等状态渐改善,最终与正常组大鼠基本接近。3.2尿蛋白改变情况:与正常组大鼠相比,其余各组大鼠造模后24h Upro水平均显著增加(P<0.05)。与模型组大鼠相比,缬沙坦组和参地颗粒组大鼠给药后,24h Upro水平均降低(P<0.05),且参地颗粒组较缬沙坦组下降明显(P<0.05)。3.3外周血中CD4+和CD8+T细胞的表达水平、CD4+/CD8+比值变化及肾组织PD-1/PD-L1通路关键分子的表达:与正常组相比较,模型组外周血中CD4+表达下降(P<0.05),CD8+表达上升(P<0.05),CD4+/CD8+比值下降(P<0.05),肾组织中PD-1、PD-L1表达升高;与模型相比较,参地颗粒组与缬沙坦组的CD4+表达上升(P<0.05),CD8+表达下降(P<0.05),CD4+/CD8+比值上升(P<0.05),肾组织中PD-1、PD-L1表达降低(P<0.05)。参地颗粒组的效果优于缬沙坦组。3.4参地颗粒组与缬沙坦组大鼠肾小球内系膜细胞增生和系膜基质增多均较模型组有所改善,且参地颗粒优于缬沙坦。4.结论4.1参地颗粒可有效降低Ms PGN大鼠的尿蛋白水平;4.2 Ms PGN大鼠存在免疫功能异常,可能与PBMC中CD4+、CD8+T细胞的异常表达,及肾组织中PD-1、PD-L1表达升高有关;4.3参地颗粒可能通过升高PBMC中CD4+T细胞的表达,降低PBMC中CD8+T表达,及下调共刺激信号PD-1/PD-L中PD-1、PD-L1的表达,调节T细胞活性,以维持机体适度的免疫功能,改善Ms PGN大鼠系膜细胞和基质的增生。