MicroRNAs(miRNAs)是大约22个碱基左右的小分子非编码RNA，在真核生物的各种发育及生理过程中起重要的调控作用。MiRNA通过与靶mRNA的互补匹配，在转录后对基因的表达进行负调控。在植物中，miRNA主要通过与靶位点的完全配对来指导靶mRNA的切断。植物miRNA除调控生长和发育这外，它们最近也被证实参与了诸如磷代谢、氧化抗逆等代谢生理过程。目前，越来越多的代谢相关蛋白和酶被预测为植物miRNA的靶蛋白。值得注意的是，在开花植物中有许多miRNA的表达受激素或逆境诱导。 许多miRNA的表达具有时空特异性，这一特性为我们了解miRNA的功能提供了重要线索。在动物miRNA的研究中，从特定组织、特定发育时期的材料中克隆和鉴定miRNA是已经是大势所趋。不过在本研究开始之前，尚无任何关于在特定植物组织中分离miRNA的报道。因此，进行这方面的研究很有必要。 植物分生组织诞生于胚胎发生时期，它通过自我更新以及制造新器官对植物的胚后发育起决定性的作用。最近的侧面遗传学证据显示，植物miRNA可能参与了分生组织的形成、分裂和分化。某些与植物miRNA生物合成相关的关键基因(如DCL1)发生突变，会引起分生组织发育不正常。那么，到底有多少miRNA参与了植物分生组织的分裂与分化的过程?这些miRNA有些什么样的特征呢?研究这些问题有助于诠释植物生长与分化的源动力。不过，鉴于植物的分生组织仅仅存在于体内根尖、茎尖、形成层等非常局限的部位，很难直接取材料进行miRNA的克隆和分析。所以，研究与分生组织分裂与分化相关的miRNA，需要建立一种简单可行的操作模型。 胚性愈伤组织来源于根尖或茎尖分生组织，可以看成是分生组织的类似物，它们能在体外大量培养。在黑暗条件下及适当培养基中生长时，胚性愈伤组织呈淡黄色，分裂非常旺盛。如果经常更换培养基，胚性愈伤组织不仅可以持续分裂，而且能长时间保持不分化的状态，它们实际上是一群肿瘤类似细胞。在添加适当植物激素的并暴露于当照条件下时，胚性愈伤组织就开始分化，变成绿色的、分化的愈伤组织；再进一步培养就会引发植株的再生，这就是所谓的体细胞胚胎发生。因此，胚性愈伤组织为我们提供了一个研究植物组织分裂与分化良好的体外模型。 本研究首先发展了一种高效的miRNA克隆的实验方法。采用此方法，本研究以水稻(Oryza sativa)．分化及未分化的胚性愈伤组织为材料提取总RNA，构建了小分子RNA的cDNA文库。从文库中随机挑取克隆子测序后，我们前后总共获得了681条随机序列，计437个条不重复的、20～24个碱基长度的小分子RNA。本研究从这些小分子RNA中鉴定了31个水稻miRNA，其中有16个(属于15个miRNA家族)为首次发现，它们在水稻基因组中共有61个前体座位。有意思的是，所有新鉴定的miRNA在物种间都不保守，显示它们可能是新近起源的。此外，我们还得到了一批候选的miRNA序列。 接下来，本研究对克隆miRNA在各类组织中的表达模式进行了分析。特别是分别采用未分化(黄色)和分化(绿色)的愈伤组织为杂交材料，以考察miRNA在愈伤组织由未分化到分化的转变过程中表达量的变化。非常有意思的是，除了部分miRNA在愈伤组织中特定表达之外，还有一批miRNA，包括miR397、miR156和miR319等，在未分化到分化的转变过程中表达量有明显的差异。通过分析miRNA的差异表达模式并结合它们的靶基因信息，我们讨论了这些miRNA可能对植物组织分裂、分化和胚胎发生等过程所起的调节作用。 采用严格的计分系统，我们为9个新鉴定的miRNA预测了60个靶基因。这些预测的靶蛋白包括转录因子、F-box蛋白、亮氨酸重复蛋白、Mlo疾病抗性蛋白、ENT结构域蛋白、蛋白激酶、DNA胞嘧啶甲基转移酶等，涉及非常广泛生理与生化过程。其中，有四个miRNA的靶基因被进一步5`RACE的实验所证实。 本研究结果还显示：所有克隆miRNA<*>都是高表达的，这表明植物miRNA的生物合成及装配进RISC(RNA Interference Silencing Complex)的机理与动物可能不一样。另外，本研究还发现miR583与一个反转座子形成一个共同的转录单位，这种新的基因组织形成可能是反转录子逃避基因组免疫的一种策略。 最后，本研究对其中一个miRNA(miR397)做了进一步的功能研究。MiR397的靶基因是一类叫漆酶的蛋白，漆酶参与木质素的合成，而木质素是植物次生细胞壁形成、加厚以及植物正常维管发育模式中所必需的。本研究通过5`RACE和Northern杂交实验，证实miR397指导了水稻漆酶mRNA的切断。更重要的是，我们除发现miR397特定在未分化的胚性愈伤组织中表达外，还证明其表达量受生长素信号的诱导而上调。结合miR397这种特殊的表达模式以及靶基因漆酶的功能，本研究提出miR397功能的一种假说：miR397通过对生长素浓度梯度作出反应，决定了漆酶在不同层次组织中的活力，进而造成各层植物组织木质化、次生生长和分化程度的差异，并最终影响分生组织分生状态的维持以及植物维管系统的发育模式。这一假想表明，以miRNA为中介，一种代谢性生理过程(木质化)与高等植物的程序性发育联系了起来。