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猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(CSF virus,CSFV)引起的一种给世界养猪业造成重大经济损失的烈性传染病。该病毒没有自身代谢机构及酶系统,必须依赖于宿主细胞完成自己的复制周期,其复制始于病毒粒子与细胞受体的特定相互作用。CSFV表面蛋白与细胞受体之间的相互作用决定了其组织嗜性和宿主范围。更重要的是,可以将阻断病毒-受体相互作用从而阻止病毒侵入作为抗病毒策略。因此,研究细胞受体不仅有助于了解病毒的侵入机制,并且可为开发新的抗病毒制剂提供精准靶标。研究表明,在CSFV侵入过程中,层粘连蛋白受体(Laminin receptor,LamR)作为病毒的吸附受体;CD46分子参与吸附过程;硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)作为细胞适应毒的吸附受体。然而,在一些CSFV非易感细胞中也有LamR、CD46和HS的表达,表明尚有介导CSFV侵入的功能性受体未被发现。因此,需要构建相关技术平台筛选介导CSFV侵入的功能性受体。之前的筛选方法基本都是以蛋白质相互作用为主,如病毒铺覆蛋白印迹技术等,而如今新兴的RNA干扰法(RNA interference,RNAi)、单倍体细胞遗传筛选、CRISPR/Cas9筛选技术已经成为生物技术领域筛选病毒细胞受体的重要工具。相较于前两者,CRISPR/Cas9技术筛选条件极其严格,Cas9核酸酶会靶向基因组DNA,使其产生永久性损伤,极大地降低了假阳性结果,筛选得到的都是调控病毒感染的关键宿主因子。本研究利用猪源细胞膜蛋白的sgRNAs文库构建基于CRISPR/Cas9技术的筛选平台,并评估其筛选效果,以期为筛选介导CSFV侵入的功能性受体奠定基础。本研究中,首先利用反向遗传操作系统构建了稳定表达Venus荧光蛋白的重组CSFV(rCSFV-Venus),并优化了重组病毒的培养条件;又利用慢病毒系统构建了稳定表达Cas9蛋白的PK-15细胞系,采用Western blotting和流式细胞术等试验筛选出Cas9蛋白表达量高、切割活性强的6#-PK-Cas9单克隆细胞株;通过分析猪源及人源膜蛋白基因的跨膜区筛选了3 500个猪源细胞膜蛋白基因,并针对每一个膜蛋白基因设计3条sgRNAs,将sgRNAs克隆至慢病毒载体后包装成慢病毒,构建猪源细胞膜蛋白sgRNAs慢病毒文库,将慢病毒文库转导至PK-15细胞中检测sgRNAs慢病毒文库的感染效率。结果显示,本研究获得了10 500个sgRNAs慢病毒,且每个sgRNA慢病毒都能够感染细胞,表明sgRNAs慢病毒文库具有筛选介导CSFV侵入的功能性受体的可用性及有效性;将sgRNAs慢病毒文库以MOI=0.3的剂量转导至6#-PK-Cas9单克隆细胞株,利用嘌呤霉素加压培养后感染rCSFV-Venus,利用流式分选系统分选出未感染病毒的细胞,提取其基因组、PCR扩增sgRNAs序列后经高通量测序来评估CRISPR/Cas9筛选平台的筛选效果。结果显示,我们筛选到12个得分较高且定位于细胞膜上的候选基因。表明本研究构建的CRISPR/Cas9筛选平台可用于筛选介导猪瘟病毒侵入的功能性受体。总之,本研究利用稳定表达Cas9蛋白的PK-15细胞、猪源细胞膜蛋白sgRNAs慢病毒文库及稳定表达Venus荧光蛋白的重组CSFV构建了CRISPR/Cas9筛选平台,可用于筛选并鉴定介导CSFV侵入的功能性受体,对阐明CSFV致病机制、发现新型抗病毒靶标、研发新型疫苗和制定新的抗病毒策略具有重要的意义,而且所建立的筛选平台可用于筛选其他猪源病毒的功能性受体。