前言:　　 砷是国际肿瘤研究机构(IARC)确定的人类致癌物,可引起膀胱、皮肤和肺等多器官肿瘤。环境砷暴露主要通过饮用被砷污染的水源,而地方性饮水型砷中毒已经成为世界范围内严重的公共卫生问题,威胁全球约两亿人群。在智利、美国和中国台湾等地大量的流行病学调查结果显示,长期饮水砷暴露增加膀胱癌的发病风险。尽管流行病学调查结果确定了砷暴露与膀胱癌的相关关系,但是相关机制尚不清楚。　　 环氧化酶(Cyelooxygenase,COX)又称为前列腺素(Prostaglandins,PGs)合成酶,是PGs生物合成过程中的一个重要限速酶,可将花生四烯酸代谢为各种PGs产物,包括PGE2,PGI2,PGF2α等,这些产物参与炎症反应和肿瘤的发生发展,其中PGE2为其主要催化产物。哺乳动物的COX有两种亚型,结构型COX-1和诱导型COX-2。COX-1在大多数组织细胞中持续低浓度表达,参与维持机体正常的生理功能;而COX-2是一种可诱导型酶,在正常生理状态下不表达,但当细胞受到一定因素如细胞因子、生长因子、致癌物等诱导后开始合成表达COX-2。越来越多的证据表明,COX-2通过控制细胞生长,细胞凋亡和核受体的信号转导参与癌症的发生发展。临床研究发现,正常膀胱脱落细胞中不表达COX-2,而膀胱癌患者的癌组织和尿脱落细胞中有COX-2表达,特别是与膀胱移行细胞癌的分级、分期和预后有显著相关性。　　 膀胱是砷毒性作用和致癌作用的主要靶器官之一,而COX-2与膀胱癌发生密切相关,并且已经有研究发现,砷能够诱导膀胱上皮细胞系表达COX-2,因此,COX-2的表达很可能介导砷诱导的膀胱癌的发生。目前,砷诱导膀胱细胞COX-2表达的机制尚不清楚。有研究认为许多化学物质和细胞因子可以通过激活IKB/NFκB通路和MAPK通路,诱导COX-2表达。那么,砷诱导的COX-2表达是否也通过激活这两条通路来实现,目前还未见报道。另外,有研究显示,活性氧自由基(Reactiveoxygenspecies,ROS)是激活这两条通路的主要物质,而氧化应激被认为是砷的致癌机制之一,那么砷是否通过产生的ROS启动信号传导通路诱导COX-2表达,仍需进一步实验证实。因此,本研究的主要目的为探讨砷诱导的COX-2表达的可能机制。本研究还选取了临床上应用三氧化二砷治疗的白血病患者这一特殊人群,分析砷的甲基化代谢和膀胱脱落上皮细胞的COX-2表达情况。　　 材料与方法:　　 1.细胞培养与砷处理　　 人膀胱上皮细胞系SV-HUC-1购自美国典型菌种保藏中心(ATCC,编号:CRL-9520),5%CO2、37℃条件下常规培养于F12K完全培养基(10%胎牛血清,100U/ml青霉素,100μg/ml链霉素)中。　　 分别设置对照组和NaAsO2处理组(1、2、4、8、10μmol/L),染毒24h后,进行各项指标检测。每组实验设3个以上平行样本。　　 2.细胞形态学观察　　 将细胞接种于12孔培养板,以0、0.5、1、2、4、8、10、20μmol/LNaAsO2染毒24h,倒置显微镜下观察细胞形态及生长状况,并采集图像。　　 3.细胞活力测定:将细胞接种于96孔细胞培养板,染毒处理后的细胞到达染毒终点前4h加入MTT溶液,继续培养至终点,吸弃培养液,加入DMSO,充分振荡使结晶物溶解,酶标仪于490nm处测定各孔吸光密度(OD)值。细胞活力用MTT的还原率表示。　　 4.细胞内ROS水平检测　　 处理后的细胞培养至指定终点时,弃培养液,PBS洗两次,每孔加入DCFH-DA(终浓度为10μmol/L),孵育后经流式细胞仪检测,以DCFH-DA的平均荧光强度代表ROS的含量。　　 5.细胞内谷胱甘肽(GSH)浓度的测定　　 砷处理后的细胞用预冷的PBS冲洗三次后收集细胞,超声破碎细胞,12000g,4℃离心5min,上清用于氧化型(GSSG)和还原型(GSH)谷胱甘肽的测定。氧化型谷胱甘肽(GSSG)收集时立即加入巯基清除剂M2VP(1-甲基-2-vinylpytidium三氟甲烷磺酸)。总谷胱甘肽浓度和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定按照BIOXYTECHGSH/GSSG-412试剂盒说明书进行(OxisResearch,Portland,OR)。还原型谷胱甘肽的浓度=总谷胱甘肽浓度-2×氧化型谷胱甘肽。同时用Bradford法测定细胞内蛋白质水平,校正细胞内GSH水平。　　 6.细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活力的检测　　 将细胞接种于直径为10cm的培养皿,按实验分组加入作用浓度分别为0、1、2、4μmol/L的NaAsO2,染毒24h后,用黄嘌呤氧化法(按南京凯基生物科技发展有限公司SOD测定试剂盒说明书)测定,同时用Bradford法测定细胞内蛋白质水平,校正细胞内SOD活力。　　 7.细胞内丙二醛(MDA)含量的检测　　 将细胞接种于直径为10cm的培养皿,按实验分组加入作用浓度分别为0、1、2、4μmol/L的NaAsO2,染毒24h后,用硫代巴比妥酸比色法(按南京凯基生物科技发展有限公司MDA测定试剂盒说明书)测定,同时用Bradford法测定细胞内蛋白质水平,校正细胞内MDA含量。　　 8.WesternBlot免疫印迹检测蛋白表达　　 细胞总蛋白和细胞核组分的分离和WesternBlot用于检测Nrf2,NQO1,HO1,COX-2,NFκB,LaminB,β-actin,p-ERK,p-p38,p-JNK和p-IKBα蛋白表达水平。　　 9.ELISA法测定细胞培养液中8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)含量　　 将细胞接种于直径为10cm的培养皿,按实验分组加入作用浓度分别为0、1、2、4、8、10μmol/L的NaAsO2,染毒24h,达染毒终点后收集细胞培养液,4℃,1000g离心20min,取上清,按ELISA试剂盒说明书测定8-OHdG含量。　　 10.RNA提取及RT-PCR检测应用TRIzol(Invitrogen)法提取总RNA,按照EasyRT-PCR试剂盒说明书将1μg总RNA合成cDNA并扩增为DNA,以β-actin作为内参,对Cox-2的mRNA水平进行相对定量分析。　　 11.前列腺素E2(PGE2)测定　　 将细胞接种于直径为10cm的培养皿,按实验分组加入作用浓度分别为0、1、2、4、8、10μmol/L的NaAsO2,染毒24h,达染毒终点后收集细胞培养液,1000g离心20min,取上清,按ELISA试剂盒说明书测定PGE2含量,同时用Bradford法测定细胞内蛋白水平以校正细胞释放PGE2含量。　　 12.研究对象:　　 病例为2009年9月至2010年1月到中国医科大学附属盛京医院诊疗的23名接受三氧化二砷(AS2O3)治疗的急性早幼粒细胞自血病(APL)白血病患者作为研究对象,年龄16岁-62岁(平均40.38岁),男性10人,女性13人。每位患者每R接受静脉滴注溶于500ml葡萄糖盐溶液的10mgAS2O3治疗。　　 13.血、尿样品采集　　 在患者或家属知情同意的前提下,采集患者血液和尿液样本。样品收集的时间点如下:AS2O3治疗前一天(0天),开始治疗的第10天(10天)和第20天(20天)。采集患者空腹静脉血15ml于真空采血管内,用于生化试验和血常规检查。收集10毫升尿液样本于15毫升聚丙烯管离心管(Sarsted,日本),放置于0-4℃冰盒中,运到中国医科大学实验室,保存于-80℃待测。　　 14.肝功能测定和血常规检查　　 白细胞(WBC),红细胞(RBC)和血小板(PLT),血红蛋白含量(HGB)和血细胞比容(HCT)应用CoulterGen-S血液分析仪(BeckmanCoulterCorporation,迈阿密,美国)测定。血清酶(ALT和AST)水平,总蛋白(TP),白蛋白(ALB),应用全自动生化分析仪(7600-020,日立公司,日本)检测。　　 15.尿形态砷测定　　 样品中不同形态砷化物分析采用氢化物发生-冷井捕集-原子吸收分光光度计法。尿液样品与2mol/LNaOH等体积比混合,于100℃恒温消化3h,采用氢化物发生-冷井捕集-原子吸收分光光度法测定样品中无机砷(iAs)、一甲基砷(MMA)、二甲基砷(DMA)和三甲基砷(TMA)含量,并以各形态砷含量之和作为总砷(Tas)含量。用尿中不同形态砷所占总砷百分比(iAs%、MMA%和DMA%)和两个甲基化指数(FMR和SMR)反映机体砷甲基化模式。　　 16.尿肌酐(Cr)测定　　 用血、尿肌酐测定试剂盒(苦昧酸法)对尿液样本Cr浓度进行测定。以尿中的肌酐(Cr)水平以校正尿砷含量。　　 17.实时定量RT-PCR分析尿脱落膀胱上皮细胞内Cox-2基因表达水平:应用TRIzol(Invitrogen)法提取总RNA,经PrimeScript反转录酶和OligodT,Random6mers,dNTP转录为cDNA。荧光染料SYBRGreenPCR试剂盒被用于实时定量PCR分析。实时荧光检测使用ABIPRISM7500SequenceDetector(AppliedBiosystems)检测。　　 18.统计分析:采用SPSS16.0统计软件(芝加哥,美国)对数据进行分析。实验数据以均数(-x±sd)表示,采用单因素方差分析(ANOVA)比较各实验组与对照组问的统计学差异,组间两两比较采用Dunnetts检验,以P＜0.05为差异具有统计学意义。　　 对人群尿砷代谢数据进行对数转化,使数据服从或近似服从正态分布后进行相应统计分析,数据结果以几何均数(G)和95%可信区间(95%CI)表示。采用重复测量资料的方差分析比较三个治疗时间点间的差异,并用StudentNewman-Keuls(SNK)法进行两两比较。采用Friedmantest对肝功能和血常规数据检进行分析。　　 结果:　　 1.亚砷酸钠致SV-HUC-1细胞氧化应激作用　　 细胞经0～20μmol/LNaAsO2染毒处理24h后,各剂量NaAsO2染毒组细胞活力均低于对照组,且染毒剂量越高活力越低,呈现明显的剂量反应关系。0～10μmol/L的NaAsO2染毒处理SV-HUC-1细胞24h后,细胞内ROS水平和GSH含量均升高,SOD活性下降,抗氧化相关蛋白如细胞核转录因子Nrf2和抗氧化酶NOO1和HO1蛋白表达水平升高,提示适应性抗氧化反应增强,以抵抗砷引起的氧化损伤。　　 2.亚砷酸钠诱导SV-HUC-1细胞COX-2表达和PGE2的分泌　　 1～10μmol/L的NaAsO2处理能够增加细胞内Cox-2的mRNA水平和蛋白水平,并且4μmol/L的NaAsO2处理组细胞内Cox-2水平达到最高。1～10μmol/L的NaAsO2处理SV-HUC-1细胞后,细胞PGE2分泌水平升高,且具有明显的剂量反应关系,这说明砷诱导的COX-2表达水平增高增加了PGE2的合成,　　 3.细胞信号传导通路在砷诱导SV-HUC-1细胞COX-2表达中的作用1～10μmol/L的NaAsO2处理能够增加SV-HUC-1细胞核蛋白NFκB表达水平,NFκB抑制剂(PDTC)能够降低砷诱导的Cox-2mRNA表达升高。1～10μmol/L的NaAsO2处理能够增加MAPK通路(ERK、p38和JNK)蛋白的磷酸化水平,MAPK通路中ERK抑制剂PD98059和U0126、p38抑制剂SB203580或JNK抑制剂SP600125均显著抑制砷诱导的Cox-2mRNA表达水平的升高,特别以ERK抑制剂作用最明显。说明核转录因子NFκB和MAPK通路在砷诱导的人正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1细胞Cox-2表达中起一定的调节作用。　　 4.氧化应激在砷诱导SV-HUC-1细胞COX-2表达中的作用　　 抗氧化剂褪黑素、巯基耗竭剂BSO和砷共同处理细胞,褪黑素能显著降低砷引起的细胞ROS产生,抗氧化蛋白(Nrf2,NQO1和HO1)表达水平的升高,COX-2表达水平升高,MAPK通路(ERK、p38和JNK)和IKBα蛋白的磷酸化水平的升高;而BSO显著增强砷引起的细胞ROS的含量增加,抗氧化蛋白表达水平的升高,COX-2表达水平升高和MAPK通路和IKBα蛋白的磷酸化水平的升高。提示,砷可以通过诱导ROS的产生和累积进一步活化IKB/NFκB通路和MAPK通路,从而诱导SV-HUC-1细胞的COX-2表达。　　 5.砷治疗白血病患者尿中各种砷化物水平和尿脱落膀胱上皮细胞COX-2表达情况　　 每日用10mg砷剂治疗后患者10天、20天尿中各种砷化物水平明显增高,显著高于用药前。反映机体对砷甲基化代谢能力的一甲基指数(FMR)和二甲基指数(SMR)均随砷治疗的持续进行而降低。砷剂治疗不同时间后分析发现男性与女性在相同的治疗时间点尿砷代谢产物及砷甲基化代谢能力的差异无统计学意义。我们对三氧化二砷治疗的急性粒细胞白血病患者尿脱落膀胱上皮细胞Cox-2mRNA的表达情况进行Real-timePCR检测分析,Cox-2表达水平变化趋势不完全相同。由此推测,亚急性、高剂量的砷暴露尿膀胱脱落细胞Cox-2的表达存在个体差异。　　 结论:　　 1.亚砷酸钠能够引起SV-HUC-1细胞氧化应激,细胞适应性抗氧化反应增强,以抵抗砷引起的氧化损伤。　　 2.亚砷酸钠能够诱导SV-HUC-1细胞COX-2表达和PGE2的分泌。　　 3.核转录因子NFκB和MAPK通路在砷诱导的人正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1细胞Cox-2表达中起一定的调节作用。　　 4.氧化应激在砷诱导SV-HUC-1细胞COX-2表达中的起重要作用,砷可以通过诱导ROS的产生和累积进一步活化IKB/NFκB通路和MAPK通路,从而诱导SV-HUC-1细胞的Cox-2表达。　　 5.三氧化二砷治疗的急性髓性粒细胞白血病患者尿脱落膀胱上皮细胞Cox-2mRNA的表达水平变化趋势不完全相同。