论文部分内容阅读
背景:肺动脉高压(Pulmonary Hypertension,PH)是以肺血管阻力(pulmonary vascular resistance,PVR)进行性升高为主要特征的病理过程,最终导致右心功能进行性衰竭和死亡。持续的肺血管收缩、过度的肺血管重塑、原位血栓的形成和肺血管硬度增大是引起PVR增高、导致肺动脉高压的主要因素。肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)和内皮细胞的过度增殖是造成血管壁增厚和管腔阻塞、引起小肺动脉和小动脉血管结构重塑,最终导致肺动脉高压的关键因素。部分家族性肺动脉高压和特发性肺动脉高压与骨形成蛋白Ⅱ型受体(BMPR2)基因突变相关,其它多种刺激和因子如低氧等都与该病有关,但大部分肺动脉高压形成的具体分子机制尚不完全明确。Notch基因家族编码一组负责细胞间信号传递的单链跨膜蛋白。研究显示Notch信号在调控PASMC增殖、分化过程中起重要作用。PH患者样本中Notch3的m RNA和蛋白表达明显增高,Notch3-HES5信号通路在人PH和小鼠低氧诱导造成的PH形成中发挥重要作用。Notch信号与低氧诱导因子HIF1α之间存在串话。低氧诱导的PASMCs增殖是低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)的主要病理改变。于是,我们推测,低氧通过诱导Notch3过表达上调其下游信号分子,激活SOC介导的钙离子通道,促进HPASMCs增殖,参与肺血管重塑和形成PH。目的:本研究利用人PASMCs培养细胞建立低氧细胞模型;通过观测Notch3表达、HPASMCs的增殖能力、细胞钙离子通道、Notch3下游信号分子的变化,以检测Notch3与HPASMCs增殖变化之间的相关性,探讨Notch3参与低氧诱导的HPASMCs增殖的可能机制。方法:采用正常人PASMCs进行低氧条件(氧气浓度3%)培养,建立低氧细胞模型;采用Notch信号通路抑制剂DAPT抑制Notch3活化;转染Notch3-si RNA抑制Notch3表达;MTT法和Brdu法检测细胞增殖;钙离子成像法检测细胞静息钙离子浓度、CPA诱导的内质网钙离子释放和恢复生理钙浓度后SOC介导的库容性钙释放(CCE)改变;Real-time PCR检测Notch3等基因表达变化;Western blot检测Notch3和m TOR通路蛋白表达变化。结果:低氧诱导的HPASMCs细胞增殖能力显著增加;低氧诱导Notch3蛋白、m RNA转录以及HES5蛋白表达明显增高;Notch3抑制剂DAPT抑制Notch3活化时低氧诱导的HPASMCs增殖受到明显抑制;Notch3-si RNA显著抑制低氧诱导的HPASMCs细胞增殖;与常氧培养相比,低氧诱导HPASMCs的细胞内质网钙离子浓度和CCE均显著增高;用DAPT抑制Notch3能显著减弱低氧诱导的细胞内质网钙离子浓度和CCE的增高;用DAPT抑制Notch3活化,低氧DAPT组比低氧对照组的p-m TOR、p-S6K和p-4EBP1显著降低;用Notch3-si RNA敲低Notch3,发现低氧Notch3-si RNA组与低氧对照组比较p-S6K显著降低。结论:低氧刺激可以通过Notch3信号通路增加细胞的CCE,促进人肺动脉平滑肌细胞增殖;抑制Notch3能够降低SOC介导的CCE并抑制低氧诱导的HPASMCs增殖;Notch3信号可能通过m TOR通路调控该功能。