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肝纤维化是由于肝脏胶原等细胞外基质(Extra Cellular Matrix ECM)合成与降解失衡，导致在肝内过量沉积。研究表明活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell HSC)是肝纤维化过程中ECM的主要合成细胞；TGFβ1是已知最强的促纤维生成的细胞因子，能促进HSC活化、增加ECM合成和沉积；因此，TGFβ／HSC轴成为抗肝纤维化治疗的一个重要靶点。sTGFβRⅡ和hIFN-γ都有抗肝纤维化作用，前者竞争性抑制TGFβRⅡ和TGFβ1的结合，从而阻断TGFβ1的生物学作用；后者通过Jak／Stat途经诱导Smad7表达、抑制TGFβ受体复合物与Smad3的相互作用，从而间接抑制TGFβ生物学活性、抑制HSC活化。sTGFβRⅡ和hIFN-γ能在不同位点阻断TGFβ1的生物学活性、抑制HSC活化，联合应用两者将可能产生抗肝纤维化的协同效应，并因减少了各自用量而降低副作用。 实验目的 构建可溶性人转化生长因子-βⅡ型受体(soluble transfouming growth factou beta receptou sTGFβRⅡ)与人γ干扰素(hIFN-γ)融合基因的真核表达质粒pSecTag2B—sTGFβRⅡ／hIFN-γ，并将pSecTag2B—sTGFβRⅡ／hIFN-γ在CHO S细胞进行表达；筛选高效表达细胞株并分析此融合蛋白的生物学活性和体外抗肝纤维化活性。 为比较sTGFβRβ／hIFN-γ融合蛋白和sTGFβRⅡ蛋白的抗肝纤维化作用，构建了pSecTag2B—sTGFβRⅡ真核表达质粒，并在CHO细胞进行表达，分析其生物学活性。 实验方法 1.通过两次亚克隆，将sTGFp班I基因和hIFN一Y基因融合构建到 pseeTagZB载体中，构建成psecT’a gZB一sTGFpR 11瓜IFN一Y真核表达质粒。将 psecl’a gZB一sTGFpRn爪IFN一Y体外转染CH0s细胞，筛选高效表达细胞株; 收集培养上清液检测sTGFpRn和hIFN一Y水平，并分析所表达的融合蛋白的 拮抗TGF困对Mvl Lu的增殖抑制活性、刺激NK细胞的活性、抗病毒活性; 进一步检测融合蛋白体外对HSC活性的影响。 2.将sTGFpR 11基因插入pseeTagZB载体构建成pseeTagZB一 sTGFpRH，将其转染CHO细胞，收集培养上清液，检测sTGFpRn并分析其 拮抗TGF田对Mvl Lu的增殖抑制活性。 实验结果 一pseeTagZB一sTGFpR 11爪IrN一Y进行酶切鉴定和测序分析结果与 预期一致，说明成功构建了pseeTagZB一sTGr p R 11/h IFN一Y真核表达质粒。 2.分析pseeTagZB一sTGFpR 11小IFN一Y转染CHos后的蛋白表达。 ELISA检测显示(OD值450lun)重组质粒的表达上清中hIFN一Y为1 .97士0.29、 sToFpR 11为1 .77士0.11，显著高于空质粒对照(分别为015士0.05、0.23士0.05) (p<0.01)和空白对照(分别为0.09士0.01、0.19士0.10)(p<o·01);Westem一blot 分析显示hIFN一Y和sTGF p RH在相同部位(约4OkDa处)出现特异性条带; 表明在CHOS培养上清中有sTGF p RH爪IFN一丫融合蛋白的表达。计算机模拟 融合蛋白二维结构表明该蛋白具有较多a螺旋和p折叠。 3.转染的CHOS经过多次有限稀释培养，上清中hIFN一丫维持在 20n留10“细胞/ml，最高达30n留106细胞/ml，表明获得高效、稳定表达的cHO S细胞株。~4.sTGFpRll瓜IFN一Y融合蛋白生物学活性:将融合蛋白和TGFpl与 Mvl Lu共同孵育后，发现2倍浓缩的融合蛋白(生长抑制率(38.7士4)%) 即能显著拮抗TGF困的增殖抑制作用(p<0.05);与正常人淋巴细胞共同孵育， 2.5倍及以上浓缩的融合蛋白能明显刺激NK细胞活性(p<0.05);和VSV病毒 与WlsH细胞一起孵育，能显著抑制VSV引起的WlsH细胞病变。表明获得 的融合蛋白具有sTGFpRll和hIFN一Y的生物学活性。 sTGFpRll加FN一Y融合蛋白体外抗肝纤维化活性:Hsc一起孵育，发现能明显减少TGF卿刺激诱导的将融合蛋白和TGFpl与HSC的ColCofHI、Q一SMA表达，表明该融合蛋白能抑制HSC活化，有抗肝纤维化潜力。 6.psecTagZB一sTGFpRll进行酶切鉴定和测序分析结果与预期一致，将psecT’a gZB一sTGFpRn转染CHO细胞进行表达，West时七lot分析显示在约20kDa处有特异性条带。培养上清液和TGF印与Mvl Lu共同孵育后，发现4倍浓缩的蛋白(生长抑制率(22.22士10)%)即能显著拮抗TGF田的增殖抑制作用(p<0.05)。表明成功构建了psecTagZB一sTGF p Rn真核表达质粒并获得有生物学活性的蛋白。 实验结论 1.成功构建T pseeTagZB/sTGF日Rll/h IFN一Y真核表达质粒 2.获得高效、稳定表达sTGF p Rll小IFN一Y融合蛋白的CHOS细胞株 3.表达的sTGF p R 11/h IFN一Y重组融合蛋白分别具有sTGF日R 11和IFNY生物学活性 4.成一构建了pseeTagZB/sTGF p R 11真核表达质粒，获得的sTGF p R 11蛋白具有拮抗TGF旦1的生物学活性 5.sTGF p Rll小IFN一Y重组融合蛋白在体外能够抑制HSC活化，有潜在抗肝纤维化作用。