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[目的]作为毛囊外根鞘一部分的bulge区是近来公认的表皮干细胞池。通过分离人毛囊外根鞘细胞,联合人成纤维细胞在Integra胶原基质支架上构建皮肤替代物进行体内体外研究,探索一种快速,简单而有效的皮肤组织构建方法。[方法]:利用除皱术获得的头皮,以0.5%Dispase液从中分离出带外根鞘的毛囊并解剖分离出其中下段,然后以0.05%胰酶-0.53Mm EDTA混合液消化分离出毛囊外根鞘细胞,用含限定性表皮细胞无血清培养基添加物的无血清培养基进行细胞的原代和传代培养。培养细胞用作细胞学研究及构建皮肤替代物的种子细胞。人表皮细胞与成纤维细胞从切除的新生儿包皮分离培养获得。分别用表皮干细胞抗体角蛋白15,角蛋白19和整合素?1对各代毛囊外根鞘细胞,表皮细胞和成纤维细胞进行荧光染色作细胞学鉴定。以Ki-67免疫荧光染色鉴定分离的毛囊外根鞘细胞的增殖活性。以细胞计数法绘制毛囊外根鞘细胞的生长曲线。种植人成纤维细胞入胶原基质构建了真皮支架后24小时,随后接种毛囊外根鞘细胞,先进行4天的三维立体液态培养,后改为气液交界面培养7天以供移植。分别以MTT和DAPI染色监测细胞在支架基质上的增殖活性。移植体外构建的皮肤替代物于裸鼠的全层皮肤缺损创面以进行体外研究,分别在2周,4周两个时相点采集创面组织标本行组织学结构分析,然后分别以HLA-A,人角蛋白MNF-116和人波形蛋白V9行免疫组化染色鉴定移植物的细胞来源。[结果]采用我们的方法分离的毛囊外根鞘细胞具有较高的增殖活性,Ki-67染色阳性。角蛋白15,角蛋白19和整合素?1的阳性染色均可见于原代毛囊外根鞘细胞和毛囊bulge区。在第二代毛囊外根鞘细胞中,角蛋白15和整合素?1的表达消失,但仍然可见角蛋白19的阳性表达。与毛囊外根鞘细胞,成纤维细胞单独接种在胶原基质支架上相比,两种细胞联合培养在胶原基质支架上显示出更高的增殖活性。该方法构建的皮肤替代物移植于裸鼠创面2周后,HE染色可见到复层的角化表皮层。HLA-A阳性表达可见于移植物皮肤全层,表皮层可见人角蛋白MNF-116阳性表达,真皮层可见人Vimentin阳性表达。4周时表皮层结构分化更完全,可见到类似于人角质层,颗粒层,棘层和基底层等样的结构。[结论]该研究显示,我们的细胞分离技术能快速分离培养出毛囊外根鞘细胞,并且这些细胞含有bulge干细胞。以含bulge干细胞的人毛囊外根鞘细胞,联合成纤维细胞在胶原基质支架上构建的皮肤替代物,移植到裸鼠创面模型后在2周内即可形成类似于人表皮和真皮的组织结构。这种构建皮肤替代物的方法简单可行,可能成为组织工程皮肤研究的一种新技术。