论文部分内容阅读
背景和目的:食管鳞状细胞癌,即食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC),因其病灶处具有丰富的粘膜下层淋巴管网络而获得极强的转移性,导致其生存率低下而预后极差,中国是ESCC的高发国家,若能找到灵敏的生物标志有利于ESCC的早期诊断和治疗。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)被证实对人类疾病尤其是肿瘤的发生发展相关基因的表达起调节作用,其中可能存在ESCC相关的生物标志。LincRNA-ROR(linc-ROR,ROR)被发现在多种肿瘤中表达上调且具有促进肿瘤生长或侵袭的能力,而ROR与ESCC的关系却鲜有报道。因此本研究检测了ROR在ESCC组织和细胞中的表达,分析了ROR表达与ESCC发病风险的关系,识别了ROR对ESCC细胞恶性表型的影响,探讨了ROR调控ESCC发生发展的信号通路机制。研究方法与结果:一、ROR与ESCC发病风险和不良预后关系的研究本研究收集了2010年淮安市第一人民医院的91例ESCC患者的癌组织及配对癌旁组织,用qRT-PCR技术检测ROR的表达,结果表明,与癌旁组织相比,癌组织中ROR的表达水平显著增高,为癌旁组织的1.717倍(p<0.001),比值比(odds ratio,OR)为2.138(p<0.01);本研究还对3种ESCC细胞株KYSE510,EC109,EC9706和1株永生化食管上皮细胞H5E46进行了ROR的表达检测,发现ROR在ESCC细胞中表达显著高于正常食管细胞,分别是其2.5倍、10.8倍和29.5倍(p<0.001)。说明ROR表达水平的升高与ESCC的发病风险显著相关,可能是ESCC的危险因素之一。本研究还收集了TCGA数据库中的96例ESCC患者的RNA测序芯片数据进行ROR与ESCC患者的生存分析,结果显示ROR表达水平较高的患者的生存时间短于ROR水平较低的患者(p<0.001),说明ROR的高表达与ESCC患者不良预后有关。二、ROR对ESCC细胞恶性表型的影响通过慢病毒转染构建稳定过表达ROR的EC109细胞株以进行后续的细胞功能试验,通过qRT-PCR检测转染效率,过表达组(处理组)细胞的ROR水平大约为阴性对照组的16000倍。分别检测处理组和对照组细胞的活力、增殖力、细胞周期、凋亡、迁移和侵袭能力。结果表明,处理组细胞的活力、增殖能力、迁移和侵袭能力均强于对照组,而凋亡率低于对照组,且处理组细胞中处于S期的细胞多于对照组。1.采用CCK-8法检测细胞活力。在给药后0.5h、1h、2.5h和4h分别检测吸光度,处理组均高于对照组,且具有时间效应关系。给药4h后,与对照组相比,处理组细胞的OD值增高了34.1%(p<0.001),处理组的细胞活力高于对照组。2.采用EdU细胞增殖检测法检测细胞增殖力。结果显示,处理组进入增殖期的细胞数占比为(35.77±3.83)%,对照组进入增殖期的细胞数所占比为(30.70±5.11)%,与对照组相比,实验组进入增殖期的细胞增加了16.7%(p<0.001)。3.采用PI染色法通过流式细胞仪检测细胞周期。处理组和对照组的G0/G1期占比分别为(62.28±2.32)%、(65.56±1.14)%,G2/M期占比分别为(13.83±0.91)%、(13.17±0.58)%,S期分别为(23.90±1.53)%、(21.27±0.44)%,(p<0.001,n=3),其中处理组进入S期的细胞比对照组增加了12.4%,相对应地,处理组的G0/G1期细胞比例比对照组降低。4.采用Annexin V-APC/7-AAD染色通过流式细胞仪检测细胞凋亡。处理组凋亡率为(8.13±0.76)%,对照组凋亡率为(11.97±2.05)%,处理组细胞的凋亡率低于对照组(p<0.05),与对照组相比,处理组的凋亡细胞减少了32.0%。5.采用Transwell小室检测细胞迁移。处理组的穿膜细胞数为50.71±6.35,对照组的穿膜细胞数为23.60±5.37,处理组的穿膜细胞数显著高于对照组(p<0.001)。6.采用Transwell小室检测细胞侵袭。处理组的穿膜细胞数为38.75±6.05,对照组的穿膜细胞数为32.19±6.42,处理组的穿膜细胞数显著高于对照组(p<0.01)。三、ROR作为ceRNA调控ESCC的信号通路分析为了进一步研究ROR可能作为竞争性内源RNA(ceRNA)参与调控ESCC的信号通路,本研究收集了TCGA数据库中的161例食管癌组织和11例癌旁组织的RNA测序芯片数据进行筛选得到差异表达基因,包括82个miRNA和1398个mRNA,筛选标准为p<0.05,容错率(FDR)<0.1,差异表达倍数(FC)≥2。在这82个miRNA中有11个和ROR有预测结合位点(TargetScan和miRanda)且在食管癌组织中表达下调,结合双荧光素酶报告基因、qRT-PCR结果选择了miR-145和miR-204作为候选miRNA。本研究分别探讨了ROR靶向miR-145/FSCN1及miR-204/MDM2参与ESCC调控的机制。1.ROR靶向miR-145/FSCN1参与ESCC迁移和侵袭能力调控的通路分析(1)采用qRT-PCR技术分析ROR对miR-145表达的影响。结果表明,过表达ROR的处理组细胞的miR-145表达量低于对照组,约为对照组的0.50倍(p<0.01)。(2)采用双荧光素酶报告基因系统分析ROR与miR-145的结合位点。选择分数最高的3个结合位点做突变,采用pmirGLO报告基因载体,共设立5个分组:(1)ROR-WT+NC mimic,(2)ROR-WT+miR-145 mimic,(3)ROR-MUT1+miR-145 mimic,(4)ROR-MUT2+miR-145 mimic,(5)ROR-MUT3+miR-145 mimic(WT:野生型,MUT:突变型)。结果表明,第(2)组的荧光信号比第(1)组显著降低,约是其0.52倍(p<0.001);第(3)(4)(5)组的荧光信号均高于第(2)组,其中第(3)和第(4)组即MUT1和MUT2与第(2)组的差异有统计学意义,分别是其1.45倍(p<0.01)和1.36倍(p<0.05)。(3)采用RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)技术验证ROR与miR-145的结合关系。共设立两个分组,即处理组和对照组,每组分别用Argonaute2(AGO2)抗体和IgG进行免疫沉淀,对产物进行qRT-PCR检测miR-145的含量。结果显示,处理组的miR-145的量是对照组的1.81倍(p<0.01)。(4)采用蛋白免疫印迹法(Western blotting,WB)验证miR-145对FSCN1的调控以及ROR对FSCN1的间接调控(以GAPDH为内参)。结果表明,转染了miR-145 mimic的组FSCN1蛋白条带的灰度值是转染了NC mimic组的0.57倍(p<0.01);高表达ROR的处理组FSCN1的蛋白条带的灰度值是对照组的1.41倍(p<0.05)。(5)过表达miR-145验证其对ROR促进ESCC细胞迁移和侵袭的逆转功能。结果显示,转染了miR-145 mimic的ROR过表达细胞的迁移能力显著抑制(p<0.001),侵袭能力也显著下降(p<0.05)。2.ROR靶向miR-204/MDM2参与P53调控的通路分析。(1)采用qRT-PCR技术分析ROR对miR-204表达的影响。结果表明,过表达ROR的处理组细胞的miR-204表达量低于对照组,约为对照组的0.27倍(p<0.01)。(2)采用双荧光素酶报告基因系统分析miR-204与MDM2的结合位点。选择MDM2与miR-204的2个序列相同的预测结合位点做突变,采用pmirGLO报告基因载体,共设立4个分组:(1)MDM2-WT+NC mimic,(2)MDM2-WT+miR-204 mimic,(3)MDM2-MUT+NC mimic,(4)MDM2-MUT+miR-204 mimic。结果表明,第(2)组的荧光信号比第(1)组显著降低,约是其0.53倍(p<0.01);且第(4)组的荧光信号比第(2)组显著升高,约是其1.75倍(p<0.01)。(3)采用双荧光素酶报告基因系统验证ROR与MDM2竞争性结合miR-204的关系。直接结合关系验证:选择ROR与miR-204的预测结合位点做突变,采用pmirGLO报告基因载体,共设立4个分组:(1)ROR-204WT+NC mimic,(2)ROR-204WT+miR-204mimic,(3)ROR-204MUT+NC mimic,(4)ROR-204MUT+miR-204 mimic。结果表明,第(2)组的荧光信号比第(1)组显著降低,约是其0.70倍(p<0.001);且第(2)组的荧光信号比第(4)组显著降低,约是其0.72倍(p<0.001)。在此结果基础上另设两组进行间接竞争性结合实验:(5)过表达ROR的处理组细胞+MDM2-WT质粒+miR-204 mimic,(6)阴性对照组细胞+MDM2-WT质粒+miR-204mimic。结果显示,第(6)组的荧光信号低于第(5)组,约是其0.87倍(p<0.05)。(4)采用RIP技术验证ROR与miR-204的结合关系。共设立两个分组,即处理组和对照组,每组分别用AGO2抗体和IgG进行免疫沉淀,对产物进行qRT-PCR检测miR-204的含量。结果显示,处理组的miR-204的量是对照组的1.25倍(p<0.05)。(5)采用WB验证miR-204对MDM2的调控以及ROR对P53的间接调控。结果表明,转染了miR-204 mimic的组MDM2蛋白条带的灰度值是转染了NC mimic组的0.83倍(p<0.05);高表达ROR的处理组P53蛋白条带的灰度值是对照组的0.64倍(p<0.05)。(6)过表达miR-204验证其对ROR促进ESCC细胞从G1期进入S期的逆转功能。结果显示,转染了miR-204 mimic的ROR过表达细胞发生了G0/G1期阻滞(p<0.01)。结论:1.ROR在ESCC组织和细胞中表达增高,其高表达可增加ESCC的发病风险,是ESCC的危险因素。2.ROR的过表达可增加ESCC细胞活力、增殖力、迁移和侵袭能力,增加进入S期的细胞数量并抑制凋亡,具有类似癌基因的功能。3.ROR可作为miRNA分子海绵竞争性结合miR-145,miR-204等miRNA并抑制其功能,以此减少FSCN1,MDM2等癌基因mRNA的降解。4.ROR可通过ROR/miR-145/FSCN1通路增强ESCC细胞的迁移和侵袭能力,并可通过ROR/miR-204/MDM2通路抑制P53通路,进而促使细胞由G1期进入S期。