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伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)感染能够引起仔猪高热、神经症状、呼吸困难,妊娠母猪流产、死胎、木乃伊等临床疾病,且隐性感染猪,终生带毒排毒,给世界养猪业造成巨大经济损失。我国是伪狂犬病毒感染的高发区之一,自1947年首个猫感染伪狂犬病毒的病例报告以来,已陆续在猪、犬、兔、貂等多种家养及经济动物中出现感染,特别是2011年以来,高致病性伪狂犬病毒导致我国很多省份猪场伪狂犬病暴发和流行,给我国生猪养殖业带来极大经济损失。本研究对伪狂犬病毒LA毒株进行了全基因组测序,分析了我国PRV ZJ01强毒变异株和传统毒株LA基因的差异位点,构建了两种毒株gI和gE基因嵌合重组病毒株,猪体感染试验发现,ZJZJ01毒株gI及gE基因变异在我国PRV流行株毒力增强方面具有重要作用。同时,以本实验室构建的ZJ01 gI/gE基因缺失毒株为基础,构建了 ZJ01 gI、gE和TK基因缺失毒株ZJ01△gI/gE/TK,其安全性高于ZJ01△gI/gE,并可完全抵抗ZJ01毒株的攻击,为该病新型疫苗研究奠定了基础。研究内容分为以下4个部分:1 猪伪狂犬病毒两个不同毒力毒株全基因组序列比较分析本实验室于2012年从我国某免疫后发病猪场分离获得一株强毒株ZJ01,猪体攻毒试验发现,ZJ01毒株对仔猪致病性显著高于一株我国早期分离的传统致病株LA。为了进一步阐明ZJ01毒力增强的分子基础,本研究在获得ZJ01毒株全基因组序列的基础上,采用Ion Torrent PGM系统方法完成了 LA毒株的全基因组序列测定。分析结果显示,LA毒株全基因组序列长141428bp,GC含量为73.66%,共有69个开放阅读框(ORFs),与已发布的PRV基因组序列相似。基因进化树分析结果表明,所有中国分离毒株构成了一个与欧美洲毒株不同的亚群,而中国传统株(LA)与中国强毒变异株(ZJ01、JS2012等)又位于该亚群中两个相对独立的分支中。LA基因组序列与ZJ01序列同源性为97.02%,而LA与ZJ01和传统的欧洲/美洲参考毒株同源性分别为95.06%和91.18%。经过比对发现,我国新发强毒株与传统毒株在多个基因存在编码氨基酸差异,在囊膜糖蛋白、被膜蛋白、酶类、衣壳蛋白和非结构蛋白中均有分布。2 PRV强弱毒株gI和gE基因嵌合重组病毒毒株的构建及毒力比较本研究选择高毒力PRV毒株ZJ01株和传统PRV毒株LA,采用BAC技术,构建ZJ01和LA毒株感染性BAC系统,通过同源重组技术,将LA株与ZJ01株的gI和gE基因进行交换,构建两个LA株与ZJ01株gI和gE基因嵌合体毒株,rLA-ZJ/EI和rZJ-LA/EI,拯救两个重组突变回复LA株与ZJ01株,即rLA株与rZJ01株。将构建成功的病毒在BHK-21细胞进行体外增殖特性鉴定,结果表明,重组rZJ-LA/EI病变形态、噬斑大小及生长曲线均与其亲本毒rZJ01接近,而重组rLA-ZJ/EI的体外增殖特性则与其亲本毒rLA相似。采用80日龄无PRV感染的健康猪进行攻毒试验,结果显示,rZJ01株攻毒后6日内全部死亡,rLA组全部存活,rZJ-LA/EI攻毒组全部死亡,但其中2头猪死亡时间推迟至第6-10天,rLA-ZJ/EI组出现1头死亡。肺脏组织中rZJ01和rZJ-LA/EI含量明显高于rLA和rLA-ZJ/EI组。该结果表明替换ZJ01 gIgE基因后,重组LA嵌合体病毒毒力有所增强,而替换LA株gIgE的重组ZJ01嵌合体病毒毒力则有所下降,表明ZJ01毒株gIgE基因的变异在该毒株毒力增强方面发挥了重要作用。3 PRV-ZJ01 gI/gE/TK三基因缺失疫苗毒株的构建本研究在实验室构建的PRV ZJ01△gI/gE毒株基础上,通过设计引物,扩增获得位于PRV强毒株ZJ01 UL23(TK)基因两侧的同源重组臂H1和H2,克隆至pUC19载体,获得中间载体pUC19-H1H2。随后将中间载体克隆至携带细菌人工染色体(BAC)载体和GFP表达盒的pHA2载体,构建转移载体pHA2-pUC19-H1H2。将pHA2-pUC19-H1H2 与 PRV ZJ01AgI/gE 毒株(缺失 gE/gI 基因的 PRV ZJ01 毒株)基因组DNA共转染BHK-21细胞,通过同源重组,获得重组病毒ZJ01-GFP△gI/gE/TK。提取该重组病毒基因组DNA,与中间载体pUC19-H1H2共转染BHK-21细胞,再经同源重组删除BAC序列,构建获得缺失gI/gE/TK基因的重组病毒ZJ01△gI/gE/TK。重组病毒ZJ01AgI/gE/TK产生的细胞病变与亲本病毒ZJ01形态一致,重组病毒连续传代20次,病毒滴度稳定,为该病毒基因工程疫苗研究奠定了重要基础。4 PRV ZJ01毒株双基因及三基因缺失疫苗毒株安全性和免疫效力比较本研究在成功构建Zr01△gI/gE和ZJ01△gI/gE/TK基因缺失毒株基础上,利用28-30日龄无PRV感染的健康仔猪,对ZJ01△gI/gE/TK和ZJ01△gI/gE进行了安全性和免疫效力比较,结果表明,ZJ01 △gI/gE/TK安全性明显高于ZJ01 AgI/gE毒株,ZJ01 △gI/gE/TK免疫后能够诱导产生高水平的血清gB抗体及病毒中和抗体,且中和抗体对传统毒株及新发强毒株均有中和能力。采用新发强毒株攻毒后,ZJ01 △gI/gE/TK免疫组仅表现轻微体温升高,无其他临床症状,能够有效抵御强毒株的攻击,并有效降低排毒,表明ZJ01 △gI/gE/TK毒株对猪体安全性高,免疫保护力强,适合作为PRV防控候选疫苗。综上所述,本研究明确了 PRV LA和ZJ01毒株的基因序列差异,发现了g][gE基因突变在PRV变异株毒力增强中的作用;成功构建了一株安全性高、免疫保护力强的三基因缺失毒株ZJO1△gI/gE/TK,为我国伪狂犬病的防控提供了科学依据和理论基础。