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干燥综合征(Sjogren’s syndrome,SS)是临床较为难治的一种主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病,泪腺、唾液腺等外分泌腺体因淋巴细胞浸润导致分泌减少,患者初期临床表现为口、眼干燥症状,病程迁延日久常伴发多种器官损害。本项目临床以《温病条辨》增液汤加减组方治疗干燥综合征获得较好疗效,因此展开系列实验研究探索其治疗机制。干燥综合征在腺体外的表现中以间质性肺炎最为多见,在中医体系中肺与大肠相表里,增液汤本身多用于治疗肠燥便秘,故在前期研究的基础上本次实验选择肺泡上皮细胞和肠上皮细胞作为观察目标。前期研究结果显示增液汤可以减少SS小鼠每日饮水量,增加唾液流率,明显缓解SS模型鼠口燥的症状,增加排便次数,减轻颌下腺、肺、肠上皮细胞淋巴细胞浸润,抑制炎症因子IL-6、IFN-ymRNA的基因转录。免疫组化实验发现增液汤可以促进颌下腺、肺上皮细胞、肠上皮细胞水通道蛋白AQP1、AQP5的表达,同时发现了 AQP1和AQP5差异的表达规律及增液汤的影响效果,这些结果表明增液汤可能通过减轻多组织的炎症反应和上调水通道蛋白表达促进了腺体分泌,增加了各组织水分转运速率,进而缓解干燥综合征动物模型的整体干燥表现,但这种治疗效果具体涉及的分子机制尚未探知,由此我们展开对增液汤调控水通道蛋白和治疗干燥综合征经由的信号转导通路的研究。目的:本项目欲探索增液汤促进水通道蛋白表达治疗干燥综合征的分子机制,在基因水平检测增液汤对与水通道蛋白和干燥综合征相关的信号通路关键蛋白的影响,并加以验证,明确增液汤调控水通道蛋白表达的信号转导过程,阐明增液汤治疗干燥综合征的“增水”机制。方法:本课题前期研究观察了增液汤对SS模型的表型及对腺体外水通道蛋白的表达影响,明确增液汤对干燥综合征模型的整体治疗作用。本项目培养原代小鼠结肠上皮细胞、原代小鼠肺泡上皮细胞,在不同浓度下观察LPS对AQP1与AQP5表达的影响,选择最佳时间点和变化较明显的细胞。加入增液汤进行干预,应用差异蛋白GO富集分析及差异蛋白KEGG通路富集分析,依据所得结果和查阅文献分析LPS和增液汤干预下影响的信号通路关键蛋白的表达,并用Western blot蛋白印迹法对与水通道蛋白和干燥综合征相关的 FAS、JAK1、JAK2、AKt-STAT、NF-κB p65、p38、p42、磷酸化 p42、磷酸化p38、TLR4等关键蛋白加以验证。结果:1.依据GO富集分析结果并结合相关文献研究,发现增液汤在细胞中主要影响到胰激肽、苯丙氨酸、胞嘧啶、生长激素、酪氨酸、谷胱甘肽、ABC转运蛋白等因素,结合以上因素及干燥综合征所涉及的信号通路,拟从与这些因素相关的信号转导系统进行研究。2.与对照组比较,LPS可明显促进FAS蛋白表达,差异显著(p<0.01)。与LPS组(p<0.01)和control组(p<0.05)比较增液汤对FAS有明显抑制作用,且48小时抑制作用明显强于24小时,与药物浓度无关,与作用时间相关,作用时间越久,增液汤对FAS的抑制作用越明显。LPS低浓度48小时可明显增强JAK1、JAK2的表达,差异显著(p<0.05),增液汤在24小时40%浓度下,对JAK1的抑制效果最明显,与control组和LPS组比较,差异显著(p<0.01);40%浓度下24小时,20%浓度下48小时,40%浓度下48小时,均能明显抑制JAK2的表达,差异显著(p<0.01)。LPS 48小时可明显增强NF-κB p65的表达(p<0.01),增液汤在24小时40%浓度下,对NF-κB p65的抑制效果最明显,与LPS组比较,差异显著(p<0.01)。LPS在48小时可明显增强p38的表达(p<0.05),但对P42的影响与对照组比较无显著性差异(p>0.05)。增液汤低浓度在48小时后,对p38的抑制效果最明显,与LPS和control组比较,差异均显著(p<0.01)。LPS在48小时可明显增强p-P38的表达(p<0.05),但对p-P42无增强作用。增液汤在24小时后,对p-P38的抑制效果最明显(p<0.01)。40%浓度下24小时可明显抑制p-P42表达,与对照组比较,差异显著(p<0.01)。与对照组比较,LPS没有增强TLR4的表达,除低浓度48小时外,其余各组均有抑制(p<0.05)。增液汤在24小时后,对TLR4的增强效果明显(p<0.05);与control组比较48小时后对TLR4抑制更加明显(p<0.05)。结论:增液汤对自身免疫类疾病干燥综合征有较好的临床疗效,前期研究发现其可通过调节颌下腺、肺泡上皮细胞和肠上皮细胞的水通道蛋白起到缓解干燥综合征水分转运障碍的作用,为进一步探讨其作用机制,本项目进行了信号通路研究,通过GO筛查及WB验证,得出如下结论。从增液汤对几条信号通路关键蛋白作用的时效看,增液汤首先抑制TLR-4,TLR-4作为膜表面炎性物质识别受体,在接收炎症物质刺激后,向细胞膜内传递信号,激活p38MAPK通路,进而激活下游NF-κB信号通路,而p38从核外向核内传递又会触动STAT1,STAT1是JAK-STAT的重要转录因子,增液汤对p38、NF-κB、JAK1的抑制可以有效控制炎症的进展。同时增液汤能明显抑制FAS,且时间越久,抑制效果越明显,而Fas又会向下游影响到NF-κB和ERK,ERK是MAPK的重要分支,MAPK会下调AQP5的。这些通路与干燥综合征具有密切相关性,既可诱发炎症,又影响到水通道蛋白的表达,增液汤对以上通路关键蛋白均有抑制作用,可以减轻炎症表现并间接促进水通道蛋白上调,缓解干燥综合征临床表现。