放疗是恶性肿瘤的一种常规治疗手段,可以引起乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结直肠癌等多种肿瘤细胞发生不同程度的自噬与凋亡,进而对肿瘤的治疗效果产生显著的影响。凋亡作为一种I型程序性细胞死亡方式,能够清除那些不利于机体的、存在潜在危险的细胞,是一个维持机体内环境稳态的主动变化过程。自噬的结局不同于凋亡,既能引起适应性反应而存活,也能产生自噬性细胞死亡,取决于不同的细胞类型、刺激发生的强度和环境因素等多个方面。自噬与凋亡的关系,两者或各自独立、或存在交互作用与分子转换,了解细胞死亡的机制对于临床上肿瘤的放射治疗具有重要价值。蛋白质精氨酸甲基转移酶5(PRMT5)在蛋白质的精氨酸甲基化中具有重要作用,参与调节细胞内多种信号分子通路的传导以及参与维持多种肿瘤相关蛋白的调控,影响细胞的增殖、分化与凋亡等多种生命进程。已有多项研究表明,PRMT5可在多种肿瘤中高表达,并与肿瘤的形成和发展以及预后密切相关。PRMT5有多个不同的选择性剪切子,PRMT5S即为其中之一。前期研究发现,电离辐射能诱导细胞表达PRMT5S,并且它可以发挥辐射增敏作用。本研究着重讨论PRMT5S在电离辐射诱导细胞死亡中的作用及其相关机制。目的:以人宫颈癌HeLa细胞作为研究对象,探讨PRMT5S在电离辐射诱导细胞死亡中的作用及其可能的调控机制,为临床上肿瘤的基因靶向治疗提供新的依据。方法:(1)细胞株:人宫颈癌HeLa细胞;(2)照射条件:X-RAD 320iX生物辐照仪,电压180kV,电流20mA,吸收剂量率为1.0Gy/min;(3)采用磷酸钙共沉淀转染法构建PRMT5基因沉默细胞模型,然后在此基础上用脂质体瞬时转染法构建不同PRMT5表型的细胞(MYC、PRMT5L、PRMT5S);(4)采用CCK8检测存活率;(5)采用克隆形成实验检测细胞的辐射敏感性;(6)采用RT-PCR与Western Blot检测mRNA与蛋白水平的变化;(7)采用流式细胞术检测自噬率与凋亡率。结果:1.电离辐射诱导HeLa细胞死亡及选择性剪切子PRMT5S的表达给予HeLa细胞电离辐射处理,CCK8实验发现,与假照组比较,8Gy组的细胞存活率显著降低,且其存活率减少的趋势呈时间依赖性改变,说明电离辐射能诱导细胞发生死亡。Western Blot实验发现,与假照组相比,8Gy组细胞的,自噬相关蛋白LC3-II的表达显著升高,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达明显增加,选择性剪切子PRMT5S蛋白的表达水平显著增高。流式细胞术实验发现,与假照组比较,8Gy组的细胞自噬率与凋亡率均明显增加(P<0.05)。以上结果提示电离辐射能诱导细胞发生自噬与凋亡,并可使PRMT5S蛋白的表达增高。2.PRMT5S在电离辐射诱导的细胞死亡中的作用给予PRMT5沉默模型电离辐射处理,克隆形成实验发现,相比于空载体对照组,沉默PRMT5后,随着辐射剂量的不断增加,细胞的克隆形成能力也在逐渐的减弱。CCK8实验发现,与假照组比较,8Gy组的细胞存活率在基因沉默组中明显降低,以上结果提示,沉默PRMT5可使辐射诱导的细胞死亡明显增加,并增加细胞的辐射敏感性。经过8Gy照射后,与假照组相比,Western Blot实验发现,在基因沉默组中,自噬相关蛋白LC3-II的表达水平显著下降;流式细胞术实验也发现,基因沉默组ShPRMT5的自噬率(14.07%)显著低于空载体对照组ShControl的自噬率(23.96%),以上结果提示,沉默PRMT5可明显降低辐射诱导的细胞自噬水平。经过8Gy照射后,相比于假照组,Western Blot实验发现,在基因沉默组中,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达水平明显增加;流式细胞术的实验结果也显示,8Gy组细胞的凋亡率在基因沉默组中明显升高(11.37%),以上结果提示,沉默PRMT5可明显增加辐射诱导的细胞凋亡水平。给予不同PRMT5表型的细胞(MYC、PRMT5L、PRMT5S)电离辐射处理,CCK8实验发现,与假照组比较,8Gy组的细胞存活率在过表达PRMT5S组中降低(33.96%)的最明显,说明过表达PRMT5S能明显增加辐射诱导的细胞死亡;在加入自噬抑制剂3-MA与凋亡抑制剂ZVAD-FMK后,CCK8实验发现,相比于假照组,经过8Gy照射后,三种细胞的存活率均降低,并且以过表达PRMT5S组降低的最为明显,也再一次证实了PRMT5S的促死亡作用。与未加药的Control组细胞相比,三种细胞的存活率在3-MA组中均降低(P<0.05),在ZVAD-FMK组细胞中均增加(P<0.05),其中以PRMT5S组的变化最为明显。以上结果提示,抑制自噬可促死亡,自噬在这里具有保护作用。Western Blot实验发现,相比于假照组,经过8Gy照射后,在过表达PRMT5S组中自噬相关蛋白LC3-II的表达显著下降,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达显著增加,提示过表达PRMT5S可显著抑制辐射诱导的细胞自噬,促进辐射诱导的细胞凋亡;在加入自噬抑制剂3-MA、凋亡抑制剂ZVAD-FMK后,Western Blot实验发现,与未加药的Control组细胞相比,经过8Gy照射后,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3的表达水平在ZVAD-FMK组细胞中降低,在3-MA组细胞中升高,尤以过表达PRMT5S组的凋亡水平最高,以上结果提示,抑制辐射诱导的细胞自噬可以促进细胞凋亡,其中PRMT5S影响着自噬向凋亡的转换过程。3.电离辐射作用后PRMT5S对组蛋白的影响给予PRMT5基因沉默模型电离辐射处理,Western Blot实验发现,相比于空载体对照组,经过8Gy照射后,ShPRMT5组细胞中H4R3和H3R2的精氨酸甲基化蛋白的表达水平均显著降低。给予PRMT5不同表型的细胞(MYC、PRMT5L、PRMT5S)电离辐射处理,Western Blot实验发现,相比于假照组,经过8Gy照射后,PRMT5各组细胞模型中的组蛋白甲基化水平变化并不明显。在不同PRMT5表型的细胞中共转染H1C的过表达质粒,然后给予电离辐射处理,Western Blot实验发现,与只转染PRMT5S组相比,共转染H1C后,自噬相关蛋白LC3-II的表达水平明显升高,以上结果提示PRMT5S能通过组蛋白H1C影响辐射诱导的细胞自噬,从而参与细胞死亡的调控。结论:1.电离辐射可使选择性剪切子PRMT5S的表达增高,并且PRMT5S能增加辐射诱导的细胞死亡,从而达到辐射增敏的作用。2.PRMT5S可抑制辐射诱导的细胞自噬,促进辐射诱导的细胞凋亡,并影响着自噬向凋亡的转换。3.PRMT5S可通过组蛋白H1C影响辐射诱导的细胞自噬与凋亡,从而参与细胞死亡的调控。