本文从不同的角度探讨了天然蒽醌类物质大黄素增强化疗药5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导肝癌HepG2细胞凋亡作用的效应及其可能机制。主要内容包括:①不同浓度大黄素(2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml)作用于人肝癌细胞系HepG2细胞2h,和以大黄素4μg/ml作用HepG2细胞不同时间(0min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、16h及24h),采用流式细胞仪(FCM)检测细胞内活性氧(ROS)水平的动态变化。②不同浓度(2μg/ml、4μg/ml)大黄素单用或与化疗药5-Fu 10mg/l联合作用于HepG2细胞不同时间,以四唑盐(MTT)比色法检测各组细胞活力的变化;FCM检测各组细胞凋亡率及细胞周期分布;透射电子显微镜观察各组细胞超微结构的变化。③2μg/ml、4μg/ml大黄素单用或与10mg/l 5- Fu联合作用于HepG2细胞24h后,采用免疫组织化学法检测各组细胞凋亡相关蛋白,如Bax、Bcl-2、AIF蛋白表达情况;利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术观察各组细胞凋亡的改变;并对各组细胞凋亡率与Bax、Bcl-2及AIF蛋白表达作相关分析。结果表明:HepG2细胞经4μg/ml大黄素处理0min、15min、30min、1h、2h、4h、8h、16h、24h后,其DCF的荧光值(代表细胞内ROS的相对水平)分别为42.67±0.80(固有ROS水平)、61.71±1.35、66.64±1.44、73.74±1.67、88.87±1.81、84.58±1.37、63.34±1.84、53.91±1.50、44.86±1.84。15min时即可观察到细胞内ROS水平的大幅度升高,2h时升高到细胞固有ROS水平的2倍左右,2～4h基本稳定在最高峰,之后逐渐降低,24h降至固有水平左右。可见细胞内ROS的产生在一定限度内呈时间依赖性。0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml和8μg/ml大黄素孵育细胞2h后,DCF的荧光值分别为46.15±1.46、63.97±1.34、73.90±1.69、86.85±1.71,可见随着大黄素浓度递增,细胞内ROS的产生呈剂量依赖性地增加。MTT比色法检测结果显示,HepG2细胞在A组(仅含DMEM,对照组)、B组(10mg/l 5-Fu)、C组(2μg/ml大黄素)、D组(4μg/ml大黄素)、E组(2μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)和F组(4μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)不同药液作用了4h、8h、16h和24h后,细胞生长抑制效应与大黄素有良好的时间和剂量依赖关系。10mg/l 5-Fu单用或者2μg/ml、4μg/ml大黄素单用均可引起活细胞的数目下降,大黄素与5-Fu联用后更明显地抑制了细胞活力,各实验组细胞存活率与对照组相比均有显著降低(P<0.05),大黄素和5-Fu联用组(E组、F组)与5-Fu单用组(B组)相比,存活率有极显著降低(P<0.01),尤以24h时差异最显著。A～F组(以下分组同上述)不同药液分别孵育HepG2细胞16h、24h和48h,以FCM检测各组细胞凋亡率及细胞周期分布。在细胞DNA直方图上,16h时我们即可观察到在DNA二倍体细胞G1峰前出现呈对称分布的“亚G1峰”,“亚G1峰”(亚二倍体峰)细胞所占检测细胞百分比即是细胞凋亡指数(Apoptosis Index, AI)或凋亡率。24h时B组(10mg/l 5-Fu)、C组(2μg/ml大黄素)、D组(4μg/ml大黄素)、E组(2μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)和F组(4μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu),细胞凋亡率分别为(7.25±1.10)%、(11.71±1.36)%、(12.98±1.67)%、(18.66±2.45)%、(27.27±2.63)%,可见随着大黄素浓度递增,各组凋亡细胞数目逐渐增多,呈剂量依赖性。而48h时最大剂量大黄素与5-Fu联用组(F组)细胞碎片明显增多,细胞坏死增多,凋亡率降低为(24.56±2.23)%,说明凋亡与继发性坏死并存。大黄素与5-Fu联合作用HepG2细胞24h后细胞周期分析显示,与对照组相比,联用组(E组及F组)使G1期细胞比例增高,S期和G2期细胞比例降低,表明大黄素与5-Fu联用可以诱导更多的肿瘤细胞凋亡并将其阻滞于G1期。以A～F组不同药液作用了24h的HepG2细胞,利用透射电子显微镜观察细胞超微结构的改变,结果发现:A组(对照组)除极少数细胞胞质内有空泡外,绝大部分结构完整,细胞体积较大,胞膜表面可见较多短的绒毛状或指状突起。胞质内细胞器丰富,结构清晰,核圆形或不规则形,核质比高,核仁明显或有多个核仁,染色质分布均匀,常染色质为主。B、C、D组,除可见形态完整的肝癌细胞外,有一定数量的凋亡细胞散在分布。E、F组,即大黄素与5-Fu联用组,凋亡细胞明显增多,尤以F组显著。结构较为完整的癌细胞仅占少数,大部分细胞处于凋亡的不同阶段。凋亡早期细胞:细胞轻微皱缩,胞膜表面突起减少。胞质电子密度略高。核轻微固缩,染色质边集;凋亡中期细胞:细胞体积变小,胞膜表面突起消失。胞质电子密度高。染色质进一步边集,有的浓缩成较大的团块,或呈圆形、半圆形边集于核膜下;凋亡晚期细胞:核固缩成团,形成凋亡小体。F组除凋亡细胞外,还可见部分细胞发生坏死:此种细胞明显肿胀,胞膜缺损,胞质内有多个空泡,核肿胀,染色质溶解。在E、F组中有些细胞核呈现凋亡样改变,而胞质内细胞器肿胀,形成大小不等的空泡,但胞膜完整,即所谓不典型凋亡改变。为了证实大黄素通过提升肝癌HepG2细胞内ROS水平来增强化疗药5-Fu促细胞凋亡作用的推论,我们进一步采用免疫组织化学法和图像分析技术检测了HepG2细胞在各组药液作用24h后凋亡相关蛋白,如Bax、Bcl-2及AIF蛋白表达情况。结果显示,Bax蛋白表达显色各实验组(5-Fu单用组除外)较对照组均明显加深,阳性细胞数目均明显增多,大黄素与5-Fu联用组(E组、F组)更甚,并且D组(4μg/ml大黄素)与C组(2μg/ml大黄素)相比、F组(4μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)与E组(2μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)相比,Bax蛋白表达前者较后者均有极显著增强(P<0.01),说明Bax蛋白表达强度与大黄素呈明显的剂量依赖性。HepG2细胞在各组药液作用24h后Bcl-2蛋白表达情况。结果显示,与对照组相比,各实验组Bcl-2蛋白表达显色均明显减弱,阳性细胞数目均明显减少,D组(4μg/ml大黄素)与C组(2μg/ml大黄素)相比、F组(4μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)与E组(2μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)相比,Bcl-2蛋白表达前者较后者均有极显著减弱(P<0.01)。大黄素与5-Fu联用组(E组、F组)Bcl-2蛋白表达比5-Fu单用组(B组)明显减少,并与大黄素有显著的剂量依赖关系。HepG2细胞在各组药液作用24h后AIF蛋白表达情况。结果发现,各实验组AIF蛋白表达显色较对照组均明显增强,差异均有显著性意义(P<0.05)。D组(4μg/ml大黄素)与C组(2μg/ml大黄素)相比、F组(4μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)与E组(2μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)相比,AIF蛋白表达前者较后者均有极显著增强(P<0.01)。同时,大黄素与5-Fu联用组(E组、F组)AIF蛋白表达比5-Fu单用组(B组)明显增强,且与大黄素呈明显的剂量依赖关系。采用TUNEL技术检测用A～F组不同药液作用了24h的HepG2细胞的凋亡改变。结果表明,从A组至F组,凋亡细胞数目逐渐增多,各组平均凋亡率依次为3%、10%、14%、18%、21%和31%。F组(4μg/ml大黄素+10mg/l 5-Fu)凋亡细胞最多,同时可见坏死细胞的存在。并且HepG2细胞凋亡率与大黄素有剂量依赖关系,各实验组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),该结果与FCM检测结果基本一致。同时,我们对A～F组不同药液作用了24h的细胞的凋亡率与本文涉及到的三种凋亡相关蛋白,即Bax、Bcl-2及AIF蛋白表达进行了相关性分析。结果显示,A～F组不同药液孵育细胞24h后,各组细胞凋亡率与Bax蛋白表达呈显著正相关(r=0.881, P<0.05);与Bcl-2蛋白表达呈极显著负相关(r=-0.942, P<0.01);与AIF蛋白表达呈显著正相关(r=0.900, P<0.05)。综上所述,我们认为,大黄素可剂量和时间依赖性地提升肝癌HepG2细胞的ROS水平,4μg/ml大黄素作用2h后细胞内ROS水平达到最高峰。不同浓度大黄素与5-Fu联合作用HepG2细胞,可时间及剂量依赖性地增强5-Fu对肝癌细胞的促凋亡作用。联用组细胞凋亡率及Bax、Bcl-2、AIF蛋白表达与5-Fu单用组相比均有极显著差异(P<0.01)。与5-Fu单用组相比,联用组细胞凋亡率及Bax、AIF蛋白表达均显著增高,而Bcl-2蛋白表达显著减少。大黄素可显著增强化疗药5-Fu诱导HepG2细胞凋亡的作用,还可能与调控Bax、Bcl-2、AIF蛋白表达有关。