顶复门寄生虫是一类严格的胞内寄生生物,对人和动物会造成严重的疾病。顶复门寄生虫的模式生物之一——刚地弓形虫(Toxoplasma gondii),全球大约有超过三分之一的人口被其所感染,免疫能力低下的个体和新生儿甚至会受到生命的威胁。弓形虫拥有如此广泛的宿主范围与它强大的入侵机制有密切的关系。钙离子作为细胞内重要的第二信使,调控着弓形虫多个生命活动,尤其是虫体入侵和逸出过程。而钙离子信号通路发挥作用需要依赖于各类钙离子相关蛋白,但是目前对于这些钙相关蛋白知之甚少,它们之间的关系也尚不清楚,鉴定它们在钙离子信号通路中的作用,以及它们的互作关系可以进一步解释弓形虫的入侵机制,为药物靶标的筛选提供依据。本研究以钙调蛋白(Calmodulin,简称Ca M)为研究对象,利用CRISPR/Cas9和Cre-Lox P系统对Ca M在RH△HX虫株中进行敲除,比较Ca M基因敲除虫株和RH△HX虫株在复制能力和入侵能力上的差异;同时,利用Bio ID技术,筛选Ca M的互作蛋白,试图发现更多的钙离子信号通路中的功能蛋白。具体实验内容如下:(1)Ca M蛋白原核表达和多克隆抗体的制备构建p GEX-KG-Ca M原核表达质粒,该质粒在表达感受态BL21(DE3)中能够顺利表达,将表达的蛋白纯化后进行动物免疫,收集免疫后的动物血清,用酶联免疫吸附法检测抗体效价,结果显示该多克隆抗体具有较高水平的抗体效价。(2)RH△HX-Lox P-Ca M虫株的构建利用Cre-Lox P系统对Ca M基因的条件性敲除。首先,构建能够识别Ca M基因座的p SAG1::Cas9-U6::sg Ca M的CRISPR质粒和同源替换的模板质粒p UC19-Ca M-YFP,然后将扩增出来的同源替换片段和p SAG1::Cas9-U6::sg Ca M质粒共同电转到RH△HX虫株的速殖子中,用黄嘌呤和霉酚酸进行药物筛选,再通过限制性稀释的方法进行单克隆的筛选,经扩大培养后用PCR和IFA进行鉴定,结果显示成功获得RH△HX-Lox P-Ca M虫株。(3)Ca M敲除株表型研究在RH△HX-Lox P-Ca M虫株的基础上,转染能够表达Cre剪切酶的质粒pmin-e GFP-Cre对Ca M基因进行剪切,从而实现Ca M的缺失。将Ca M的缺失株与RH△HX虫株同时进行胞内复制实验和入侵实验,发现缺失株和RH△HX虫株在胞内的复制能力没有多大的差异;但是缺失株的入侵能力有明显缺陷,入侵能力较RH△HX虫株显著性下降。(4)Bio ID技术筛选与Ca M的互作蛋白用生物素标记经过遗传改造后的虫株RH△HX-Bir A*-Ca M和原始虫株RH△HX,经过24h的作用后,通过间接荧光免疫和Western-blot检测到RH△HX-Bir A*-Ca M虫株有被生物素标记上的特异蛋白,为了进一步确定这些蛋白,我们进行了质谱分析。经过质谱结果的分析对比,从本实验得到25个特异性的蛋白质。对鉴定到的这些蛋白质进行功能和定位的分析,推测内膜复合物(IMC)和果糖1,6-二磷酸醛缩酶与Ca M存在互作的可能性,但它们之间具体的关系还需要进一步实验验证。本研究主要利用Cre-Lox P条件性敲除系统和CRISPR/Cas9技术在RH△HX虫株中对基因进行敲除。敲除株和RH△HX虫株比较得出:敲除株在复制能力上有缺陷,但是在胞内复制的能力没有明显差异。同时通过Bio ID技术和LC-MS/MS鉴定出25个特异性蛋白,以上结果希望能够为弓形虫入侵机制的研究进一步提供理论基础。