粘虫中肠α-淀粉酶的纯化、鉴定及其小分子抑制剂研究

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本文通过对粘虫中肠α-淀粉酶的纯化、性质研究、活性测定参数优化、小分子抑制剂的筛选以及小分子抑制剂Z25、C24对粘虫幼虫的生物活性和对α-淀粉酶活性的影响,初步阐明了粘虫中肠α-淀粉酶的酶学性质和小分子抑制剂对α-淀粉酶的影响,旨在为昆虫α-淀粉酶抑制剂的开发提供依据。 采用硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤等方法,从粘虫5龄幼虫提纯了α-淀粉酶。提取液非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定出现1条酶带。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定,粘虫中肠α-淀粉酶有两个亚基,分子量分别为56kDa,68kDa;最适pH和温度分别为8.0和45℃;重金属离子Co2+、Ni2+、Zn2+、Cu2+、Cr3+、Cd2+对α-淀粉酶具有显著的抑制作用,Cs+表现为激活作用,Mn2+和Ba2+在不同浓度时对α-淀粉酶的影响不同;轻金属Na+、K+和Mg2+对α-淀粉酶均有激活作用;但Li+、Ca2+和Al3+对α-淀粉酶表现为抑制作用。 筛选了11种不同参数组合的α-淀粉酶活性测定方法,并对其中最适组合的各个参数进行了优化。结果表明:在离体测定条件下,粘虫中肠α-淀粉酶活性的最优化测定参数为0.03mol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0,含有55mmol/L NaCl)、温度45℃、吸收波长480nm。Ca2+对α-淀粉酶活性具有抑制作用。该优化法能够显著降低粘虫、德国小蠊、黄粉虫、淡色库蚊和家蝇等昆虫α-淀粉酶的米氏常数Km值,且粘虫和德国小蠊α-淀粉酶的Vmax值增大,但黄粉虫、淡色库蚊和家蝇α-淀粉酶的Vmax值均明显减小。 测定了3 1种化合物对α-淀粉酶活性的影响,发现酸性化合物对淀粉酶具有强烈的抑制作用,环糊精具有中等程度的抑制作用,抗坏血酸和巯基抑制剂对α-淀粉酶具有明显的激活作用,不同类型化合物对α-淀粉酶均具有不同程度的激活作用。 室内毒力研究表明,两种新型昆虫生长调节剂Z25和C24对粘虫具有很强的毒杀作用,同时对粘虫2龄幼虫取食行为具有明显的抑制作用,生长发育具有阻断作用。但两种药剂的毒杀作用效果比较缓慢,24h后死亡率较低,处理时间48h为宜,且Z25的杀虫活性较C24好。Z25和C24采用饲料混药法和浸叶法处理粘虫2龄幼虫,短时间内均对α-淀粉酶产生诱导效应。随着处理时间的延长,最终表现为抑制作用。这些生理特征可能影响幼虫的取食、能量代谢和组织分化,从而影响昆虫的生长发育。
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