近年来,由水稻瘤矮病毒(Rice gall dwarfvirus,RGDV)引起的水稻瘤矮病在我国广东、福建、海南省稻区发生流行,成为我国南方稻区的重要病害之一,对水稻产量造成影响。RGDV隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus),主要由介体电光叶蝉以持久增殖方式进行传播。目前,对RGDV的研究主要集中在基因组结构与功能、寄主及介体细胞内的侵染概况等,关于RGDV在介体电光叶蝉内进行垂直传播的研究很少。本研究通过预设带毒情况不同的雌雄电光叶蝉进行群体交配并检测子代的带毒率,实验数据表明,带毒雌虫与无毒雄虫交配时,子代带毒率为18%左右。然而,当带毒雄虫与无毒雌虫交配时,子代带毒率可高达到70%左右。明确带RGDV的雌虫和雄虫都能将病毒传给子代,并且雄虫在垂直传播中起重要作用。1、RGDV经雌性垂直传播本课题组前期通过免疫荧光标记及电镜观察,发现在电光叶蝉雌虫体内RGDV可能借助非结构蛋白Pnsl1装配形成的管状结构进行经卵传播,但对于其中的机制尚不明确。本研究通过免疫荧光及透射电镜观察,推测Pns11管状结构可能与电光叶蝉肌动蛋白(Actin)相互作用来推动小管克服卵传屏障。通过双链RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术抑制带毒电光叶蝉体内Pns11表达,同时设置干扰GFP蛋白表达为对照组。解剖干扰后雌性电光叶蝉的生殖系统,通过Western Blot检测双链RNA干扰对Pns11蛋白表达量的影响。选取干扰效果明显的批次进行交配实验,检测亲代个体和子代的带毒率。结果表明干扰交配的带毒雌性体内Pns11的表达,子代带毒率仅为5.3%,与对照组21%相比显著降低。此外,通过GST pull-down、酵母双杂交等实验验证了 Pns11与电光叶蝉Actin之间存在特异性互作。进一步证实,RGDV侵入电光叶蝉卵细胞可依靠Pns11管状结构与Actin的相互作用来提供小管穿过滤泡细胞和微绒毛骨架等入卵屏障的动力。2、RGDV经雄性垂直传播通过群体交配实验发现带毒雄虫在垂直传播病毒的过程中起重要的作用。免疫荧光标记和电镜观察发现RGDV病毒粒体主要是粘附于精子的精核表面。实验室同期研究采用原核表达的RGDV编码的外壳蛋白(P2、P8)及非结构蛋白Pns11预先体外预孵育健康电光叶蝉精子,然后再进行提纯病毒孵育。结果发现RGDV P8可以体外结合在精核质膜表面。为了探究RGDV P8粘附于精核质膜表面的作用机制,我们用GST pull-down技术从精子可溶性总蛋白中"钓取"与RGDV P8相互作用的精子蛋白。结果从电光叶蝉精子蛋白中"钓取"出与RGDVP8发生互作的高密度脂蛋白结合蛋白(Vigilin)、硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG)等十种候选互作蛋白。利用昆虫杆状病毒表达系统在Sf9细胞中验证了 RGDV P8与HSPG及Vigilin蛋白之间确实存在互作。当RGDVP8与HSPG共表达时,二者完全共定位于细胞质膜、细胞质以及核膜周围。当RGDV P8与Vigilin共表达时,二者均匀的弥散分布在细胞质中并且完全共定位。运用双分子荧光互补实验,明确RGDV P8与精子Vigilin及HSPG蛋白可以在本氏烟中互作发出黄色荧光。通过本氏烟共定位实验观察到RGDV P8蛋白与精子的Vigilin主要定位在细胞质膜及细胞骨架上,与HSPG主要定位在细胞质膜上。综上所述,本研究初步证明RGDV不仅可以通过雌虫将病毒传递给子代,还可以通过雄虫进行垂直传播且起到重要的作用。带毒雌虫可通过病毒编码的Pns11与电光叶蝉自身的Actin发生互作,为包裹病毒粒体的Pns11管状结构提供突破入卵屏障的动力。带毒雄虫垂直传播RGDV主要是通过病毒编码的P8蛋白与精核质膜表面的Vigilin及HSPG等蛋白发生互作,粘附在精子表面随受精过程进入卵内传播至子代。因此,本研究对RGDV侵染电光叶蝉卵细胞及借助精子细胞为载体进行垂直传播的机制进行了初步的研究,为阻断RGDV垂直传播提供新的思路和理论依据。