肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,文中缩写为肝癌)是全球第三大癌症死亡原因。它归因于多种基因突变和表观遗传改变。乙型肝炎病毒(HBV)感染、酒精、黄曲霉毒素、肥胖和糖尿病是肝癌的其他危险因素。尽管肝癌的诊断和治疗有很多新方法,但由于高复发率和转移率,预后仍然较差。预后不良的一个重要原因是缺乏准确的HCC预后分级系统和有效的早期HCC筛查方法。因此,评估潜在的生物标志物在HCC诊断和治疗中的价值是合理的。本研究首先在癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中筛选肝癌预后相关的mRNA表达数据,然后对我院肝癌标本进行转录组测序基因分析,挖掘可能与预后相关的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),接着我们筛选到ARHGEF39作为候选基因并进行验证。ARHGEF39基因,又称C9orf100,是鸟嘌呤核苷酸交换因子(RhoGEFs)人类Dbl(Diffiuse B lymphoma)癌基因家族成员之一,是Rho家族的小分子鸟苷酸三磷酸酶(Rho GTPases)的重要激活因子。ARHGEF39在多种人类癌症中存在高表达,比如肺癌、胃癌和肝癌。这些数据表明,ARHGEF39可能在不同的癌症类型中频繁上调,并与肿瘤进展相关。既往有报道称,肝癌标本中ARHGEF39的mRNA水平较邻近非肿瘤组织明显上调。ARHGEF39基因水平表达上调和肝癌肿瘤数目及血清AFP高低呈正相关性。然而,我们对ARHGEF39蛋白在肝癌中的表达及预后相关性仍知之甚少。为了探究ARHGEF39在肝癌中的表达与临床病理特点及预后的关系,以及预测ARHGEF39与肝癌进程的关系,利用TCGA挖掘肝癌中ARHGEF39的表达信息和对应的临床病理资料,分析ARHGEF39在肝癌和癌旁组织中的表达情况以及与肝癌患者临床特征及预后的关系。并在我们肝癌标本中验证,结果显示ARHGEF39在肝癌组织中的表达高于癌旁组织(P<0.05)。ARHGEF39表达水平与TNM分期、血清甲胎蛋白(AFP)水平呈正相关P<0.05)。COX多因素分析显示ARHGEF39过表达、TNM分期、Child-Pugh评分是肝癌患者生存的独立预后指标。ARHGEF39可作为促癌基因在肝癌患者的肿瘤组织中呈高表达,提示肝癌患者预后不良,有望成为早期诊断肝癌的分子标志物和判断预后的指标。进一步地在前一部分研究的基础上,我们探讨ARHGEF39对肝癌生长和转移的影响及其潜在分子机制,长非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)是一类细胞中大于200bp不具有编码蛋白功能的RNA.越来越多证据表明lncRNAs参与肿瘤细胞的多种调控过程,包括分化,增殖,凋亡,转移,干细胞特性等。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)是属于基因进化历程中具有保守性的短非编码RNA,可以结合mRNA的3’端非翻译区(3’untranslated region,3’-UTR)对其进行转录后调控,MiRNAs也被报道在包括转移,凋亡,增殖,分化等多种细胞过程中起作用。研究报道lncRNA可作为竞争性内源RNA通过竞争性结合相同的miRNAs位点,抑制miRNAs对下游靶基因的靶向作用,提高靶基因的表达,从而调控肿瘤的进程。通过生物信息学分析及预测,我们提出了科学假说:ARHGEF39 通过与 lncRNA LINC00470 竞争 MicroRNA-4500(miR-4500)的活性位点来促进肝细胞癌的进展,于是我们通过体内细胞学及体外动物实验,证实LINC00470可通过吸附miR-4500上调ARHGEF39的表达;此外,解救实验显示,miR-4500抑制剂可以消除LINC00470抑制肝癌细胞进展的作用。因此,我们证明了 LINC00470可以作为miR-4500的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA),通过调控ARHGEF39的表达来促进肝癌的进展,这为肝癌患者的治疗提供了一个潜在的治疗靶点。第一部分基于TCGA数据库肝癌相关基因分析及筛选目的:肝癌是导致癌症相关死亡的主要原因之一。本研究的目的是利用生物信息学分析,识别与肝癌发展相关的潜在中枢基因和失调通路。方法:1、基于癌症基因组图谱(TCGA)数据库的肝癌组织mRNA表达谱分析,筛选肝癌预后相关的mRNA表达数据2、收集19对肝癌及癌旁组织的新鲜标本,随机选择5对进行转录组测序,并进行分析,寻找癌与癌旁DEGs,并绘制火山图和聚类图。3、我们筛选了两个平台的DEGs,通过选择这两个平台的交集,我们在来自TCGA数据库及本院肝癌标本队列的测序数据中找到了共同的DEGs。4、对交集的DEGs进行功能和通路富集分析。5、RT-qPCR验证候选基因在19对肝癌及癌旁组织中的表达情况。6、利用TCGA公共数据库中的肝癌数据进行Kaplan-Meier生存分析,了解候选基因与肝癌生存预后关系结果:1、利用TCGA数据库,筛选出肝癌及癌旁组织DEGs共1588个,其中在肝癌中高表达1520个,低表达68个;组织样本转录组测序共筛选出1281个DEGs,其中肝癌组织对比癌旁组织有873个mRNA表达呈上调趋势,有408个mRNA表达呈下调趋势。2、通过分别TCGA数据及本院组织样本转录组测序的数据交集联合分析,我们在肝癌中获得了 341个高表达的DEGs和31个低表达的DEGs。3、GO功能富集分析结果显示这些基因生物途径主要富集在浓缩核染色体外着丝点、Ndc80复合体、染色体乘客复合体等生物学过程。KEGG通路分析显示基因DNA复制、细胞周期等通路中富集。4、通过我们的分析,NT5DC2、ARHGEF39、SPSB2、SLC26A6、SLC52A2 被筛选作为候选基因。5、上述5个基因在我们的19例肝癌组织及相应的癌旁组织中的使用qPCR方法成功验证。6、TCGA数据分析显示候选基因的表达高低与肝癌患者的预后具有相关性。结论:本研究为肝癌发生的转录组解读和分子机制的研究提供了有用的信息,为开发新的生物标志物和进一步深入的研究提供了依据。第二部分ARHGEF39在肝细胞癌中的表达及其预后意义目的:既往研究报道ARHGEF39可能在不同的癌症类型中上调表达。然而,ARHGEF39表达水平与肝癌患者临床病理特点及预后的关系尚不清晰。因此,我们拟开展本部分实验对上述问题展开研究。方法:1、分析肝癌基因组图谱(TCGA)数据集中ARHGEF39的表达水平,通过TCGA数据库数据分析ARHGEF39与肝癌患者预后的关系。2、从基因和蛋白水平,分别验证我们收集的肝癌及癌旁组织中ARHGEF39的表达情况3、此外,我们还研究了 ARHGEF39表达与肝癌的临床病理特点及预后的关系。结果:1、TCGA数据显示,ARHGEF39在肝癌中呈高表达(P<0.05)。高水平的ARHGEF39是不良总生存(OS)的一个重要预后因素(TCGA,P=0.006)。2、肝癌标本中ARHGEF39 mRNA和蛋白的表达水平明显高于邻近肝标本(P<0.05)。3、我们调查了 ARHGEF39和患者的临床病理学特征之间的相关性,发现ARHGEF39高表达水平与肝癌的与血清甲胎蛋白(AFP)的水平(P=0.002,9.597)和 TNM stage(P=0.040,χ2=4.654)的显著正相关。4、进一步分析发现,高ARHGEF39水平与低OS(P<0.001)和短无病生存(DFS)(P<0.001)显著相关。Cox多因素分析显示,ARHGEF39是OS和DFS的一个独立的、不利的促进因素(P=0.000)。结论:ARHGEF39可能在肝癌的进程中作为癌基因发挥作用,可能是潜在的肝癌预后预测指标和治疗靶点第三部分LINC00470竞争性结合m i R-4500调节ARHGEF39的表达影响肝癌细胞恶性进展目的:基于第二部分研究,本部分研究旨在探究ARHGEF39在肝细胞癌中具体的功能和调控机制。方法:本部分主要通过分子生物学、生物化学的手段以及一系列体外细胞学功能实验(人肝癌细胞HepG2、Hep3B)和体内动物模型(人肝癌Hep3B细胞株)探究ARHGEF39在肝细胞癌中具体的功能和调控机制。1、通过qRT-PCR的方法检测ARHGEF39,miR-4500和LINC00470等相关基因的RNA水平;2、通过WB验证ARHGEF39的蛋白水平表达;3、MTT assay和克隆形成实验检测不同处理后细胞的体外生存能力;4、Caspase 3/7 activity assay 和 Nucleosome ELISA assay 检测细胞凋亡水平;5、Transwell assays检测细胞的体外迁移和侵袭能力;6、小鼠荷瘤体内动物实验评估对人肝癌Hep3B细胞ARHGEF39敲低后在体内肿瘤生长能力的影响;7、荧光素酶报告实验检测miR-4500对ARHGEF39和LINC00470的抑制作用;8、生物素标记的 RNA pulldown 技术检测 miR-4500 对 ARHGEF39 和 LINC00470的直接结合作用。结果:1、体外实验结果显示:下调ARHGEF39的表达抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭并促进其凋亡。2、敲低ARHGEF39抑制人肝癌Hep3B细胞株的体内肿瘤生长能力;3、ARHGEF39 在人肝癌细胞 HepG2、Hep3B 中被 miR-4500 负调控;ARHGEF39作为miR-4500靶基因,其表达水平可被miR-4500表达上调所抑制,表明在人肝癌细胞系中ARHGEF39-miR-4500负性调节关系的存在4、LINC00470扮演miR-4500的“海绵”角色调控ARHGEF39的表达;5、ARHGEF39对人肝癌细胞的恶性进程的效应依赖于LINC00470/miR-4500信号轴。结论:LINC00470通过吸附miR-4500促进ARHGEF39表达来调控肝癌的恶性进程,ARHGEF39至少部分通过LINC00470/miR-4500/ARHGEF39信号轴信号轴来促进人肝癌细胞HepG2、Hep3B的体外增殖,迁移和侵袭能力,以及抑制肝癌细胞体外凋亡能力。ARHGEF39,LINC00470,miR-4500可成为肝癌诊断和治疗的潜在靶标。