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中能重离子束诱变育种具有诱变率高和突变谱广的特点,广泛运用于植物诱变育种工作中。豆科植物的离子束诱变育种工作已经多有开展,并且取得了丰硕的成果,但其诱变机理研究还相对缺乏。本研究以豆科模式植物百脉根(生态型:MG-20)为研究材料,采用碳离子束辐射百脉根干种子,从M2代群体进行突变体筛选,对突变率和突变谱进行量化分析,并使用ISSR技术对辐射后代进行遗传多态性表征。M2群体筛选获得了花瓣衰老延迟突变体(Petal senescence delayed,PSD),借助全基因组重测序分析和转录组测序分析寻找PSD的突变基因和差异表达基因。对转录组数据进行深入挖掘,探索百脉根花瓣衰老的基因调控网络。 使用兰州重离子研究装置(Heavy Ion Research Facility in Lanzhou,HIRFL)提供的能量为80MeV/u的碳离子束辐射百脉根干种子,辐射的剂量为0、100、200、300、400、500和600Gy,统计M1代的萌发率、存活率和根长。结果表明萌发率与剂量无相关关系,存活率与根长随剂量升高而下降。最终选择400Gy作为半致死剂量,辐射1200粒M1代种子,从2472份M2个体中筛选获得127个表型发生变异的个体。突变群体的变异类型包括叶突变、茎突变、花突变和果实突变,总突变率为5.14%。然后采用简单重复序列间区(Inter simple sequence repeat,ISSR)分子标记技术分析M2代植株的基因组DNA多态性。选取了7个有突变表型的M2个体和8个没有突变表型的M2个体进行ISSR分析,多态性条带为4条,其中7个有表型个体中共发现2条多态性条带,多态率为0.607%,8个无明显表型个体中有2条多态性,多态率为0.532%,两组间无显著差异,总多态率为0.567%。 碳离子束辐射百脉根获得PSD突变体未见报道,该突变体花瓣衰老延迟显著,具有较大的研究价值和潜在的经济价值。结果表明PSD单朵花的花期比野生型(WT)长10天以上,PSD的果荚比WT略短,种子数比WT略少,但均不能到达显著差异水平。生长周期、植株形态、叶型和花型均与WT无显著差异。台盼蓝染色实验和半薄切片实验结果表明:授粉后PSD花瓣细胞存活时间长于WT;花瓣萎蔫后,PSD台盼蓝染色区域少于WT,细胞结构较WT完整。通过重测序与转录组关联分析,推测CUFF.19232为引起PSD花期延长的突变基因。CUFF.19232注释为木瓜蛋白酶类的半胱氨酸肽链内切酶(CysEPs),包含了一类C-末端KDEL类内质网保留信号因子(KDEL-CysEPs),与拟南芥AT5G50260(KDEL-CysEPs)相似率为82%,具有泛蛋白酶特点。该基因的具体的功能还需进一步研究。 花瓣衰老是植物生长发育的重要过程之一,百脉根中花瓣的衰老调控机制仍不甚明了。本研究以百脉根野生型材料(WT)为主要研究对象,探索参与百脉根花瓣衰老的基因,并用PSD突变体作为验证。通过对WT和PSD中差异表达基因的分析,筛选出4个关键衰老相关基因和22个泛素化相关基因参与了百脉根花瓣衰老。74个转录因子家族参与百脉根花瓣衰老的信号传导,其中AP2-ERFBP家族成员最多。并筛选出参与百脉根花瓣衰老的7种植物激素相关基因,其中乙烯合成关键基因ACS1和ACO1表达上调,多个乙烯响应转录因子(RAP2-3,ERF010,ERF060和ERF112)表达上调。对这些基因的RT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。体外喷洒乙烯生物合成中间体1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid,ACC)和抗乙烯剂硫代硫酸银(silver thiosulfate,STS)实验表明,ACC能够加速花瓣衰老,STS则能够有效延缓花瓣衰老,进一步说明乙烯是参与百脉根花瓣衰老的关键因素。 通过上述研究,建立了中能碳离子束辐射百脉根M2代突变体库,并且用分子标记方法考察了辐射诱变对后代DNA多态性的影响。花瓣衰老突变体经基因组和转录组关联分析,初步认为CUFF.19232是引起PSD花瓣衰老延迟的突变基因。另外,本研究对百脉根花瓣转录组进行了深入挖掘,探索了参与百脉根花瓣衰老的基因,证明了授粉是花瓣衰老的一个重要时间点,而且乙烯在百脉根花瓣衰老中有重要作用。