论文部分内容阅读
目的: 1.构建DSP基因点突变真核表达载体。 2.将DSP基因点突变真核表达载体转染细胞,观察真核表达情况。 方法: 1.质粒pDSP-EGFP-N1用定点突变技术构建桥粒斑蛋白点突变真核表达载体p-mutDSP3925-EGFP-N1。将野生型和突变型桥粒斑蛋白基因克隆分别转化DH-5α大肠杆菌感受态细胞,经卡那霉素抗性筛选阳性菌落,挑取阳性菌落,摇菌扩增,小制备提取质粒,并纯化质粒。经Xba I和Age I单酶切或双酶切,根据酶切后DNA电泳结果剔除假阳性克隆。经酶切鉴定后的阳性克隆进行PCR测序反应,测序PCR产物经纯化后,用测序仪进行核苷酸测序。测序序列经比对后确认DSP基因点突变发生。将测序证实的点突变克隆转化感受态细菌,扩菌后,用大提法制备野生型和突变型桥粒斑蛋白克隆质粒,备用。N2A细胞用含10％胎牛血清的DMEM培养,胰蛋白酶消化传代培养。用于显微观察的细胞贴附生长于小玻片上,应用Lipofectamine2000转染试剂,将野生型和突变型DSP分别转染N2A细胞株,24小时后,在荧光显微镜下观察小玻片上N2A细胞的质粒转染情况。用于蛋白分析的细胞,传代培养于培养皿中,细胞经转染后24-36小时,用细胞刮子收集贴附生长细胞,裂解液裂解细胞提取总蛋白,用免疫共沉淀方法鉴定突变体功能改变。 结果: 1.构建的真核表达载体pDSP-EGFP-N1的酶切鉴定结果符合预期,即Age I和Xho I单酶切产生产生大小为13kb左右的线型DNA片断,而Age I和Xho I双酶切则产生大小分别为8kb、4kb和1kb的线型DNA片断。 2.采取健康青年人的全血,对提取的基因组DNA用PCR扩增DSP基因3646A>G点突变区域的DNA片断,经Acl I限制酶消化后进行电泳,结果显示所检测的120份样品没有出现酶切片断的产生。 3.对含有野生型DSP基因的质粒pDSP-EGFP-N1通过定点突变技术,经突变诱导PCR后,对PCR产物用Xho I限制酶消化,电泳后结果显示,突变体DNA产生清晰的大小为13.5kb的片断。 4.将突变体转化感受态大肠杆菌后,接种于青霉素和卡那霉素双选培养板,经37℃孵育18小时后挑取阳性菌落。阳性菌落经液体培养基扩菌后,用小提质粒DNA方法提取的质粒基因组DNA,酶切后电泳结果显示3个菌落符合预期。 5.对符合预期的质粒进行测序鉴定,测序结果证实A>G的生成。 6.经过酶切和测序鉴定证实的突变体p-mutDSP3925-EGFP-N1继续进行大量扩增和采用大提质粒DNA的方法提取不含内毒素和致热原的DNA,经酶切确认,再进行质粒全基因组测序的结果显示序列全部正确。 7.应用Lipofectamine2000转染试剂分别用野生型DSP和突变型DSP质粒转染神经胶质瘤来源的细胞株N2A细胞,在荧光显微镜下观察到野生型和突变型均能够成功转染细胞,但突变型DSP在细胞内定位集中在胞内区域,而野生型DSP分布于胞膜区域。 8.对转染质粒后的细胞蛋白进行免疫共沉淀分析的结果显示,DSP与膜蛋白Cx43发生共沉淀,同时显示,突变型DSP与Cx43的共沉淀强度低于野生型。 结论: 1.在DSP基因中成功诱导产生了3646A>G点突变。 2.构建的真核表达载体可有效转染真核细胞,转染突变型DSP的细胞DSP的细胞内定位发生改变。 3.DSP基因3646A>G点突变可能是致心律失常性右室心肌病的相关因素。