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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害全球养猪业的重要疫病之一,其病原猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的非结构蛋白(nsps)在调控病毒的复制和致病中发挥着重要作用。研究PRRSV nsps与宿主细胞蛋白之间的相互作用及其生物学功能,对于阐明PRRSV复制和致病性的分子机制具有重要意义。本研究围绕PRRSVnsp2、nsp10、nsp11与宿主细胞蛋白DDX18、IRAK1的相互作用及其影响病毒复制的分子机制开展研究。在实验室前期研究发现宿主细胞蛋白DDX18分别与PRRSV nsp2和nsp10存在潜在相互作用的基础上,本研究采用免疫共沉淀(Co-IP)技术进一步证实DDX18可以分别与nsp2和nsp10互作,并确定了 nsp2的N端(PL2结构域)可以分别与DDX18的N端(DEXDc结构域)和C端(HELICc结构域)发生相互作用,DDX18 C端(HELICc结构域)又分别与nsp10的N端(ZBD结构域)和C端(解旋酶结构域)发生相互作用。利用间接免疫荧光技术和激光共聚焦显微镜分析发现,DDX18可以从细胞核移位至细胞质,并分别与nsp2和nsp10共定位于细胞质中。沉默MARC-145细胞中DDX18基因的表达可以显著抑制PRRSV的滴度及ORF7的拷贝数,过表达DDX18蛋白则可增加PRRSV的滴度以及ORF7的拷贝数。以上研究结果提示PRRSV nsp2和nsp10与宿主细胞蛋白DDX18的相互作用可以促进PRRSV的复制。利用杂交瘤技术制备出一株抗PRRSVnsp11的单克隆抗体,命名为3F9,并鉴定出3F9所针对的nsp11抗原表位序列为“DCREY”。利用单克隆抗体3F9研究PRRSVnsp11与宿主细胞蛋白之间的相关性,发现nsp11与IRAK1之间存在互作。分析发现,nsp11与IRAK1共定位于细胞质中,沉默IRAK1基因表达可抑制IFN-β产生,从而促进PRRSV复制;过表达IRAK1蛋白则可抑制PRRSV复制。在MARC-145细胞中,PRRSV的感染可以抑制IRAK1蛋白的表达。进一步研究发现,PRRSV 感染可以上调 mml-miR-146a(MacacamulattamicroRNA-146a)的表达,后者靶向 IRAK1 3’UTR进而抑制 IRAK1 的表达,而 Inhibitor-mml-miR-146a 可以降低 PRRSV 对 IRAK1蛋白表达的抑制作用,并且呈剂量依赖性。此外,研究发现下调IRAK1蛋白的表达可以抑制IRF7蛋白的表达,进而抑制IFN-β的产生;mml-miR-146a还可以直接作用于PRRSV的基因组而抑制PRRSV的复制。上述研究结果证实了 nsp11与IRAK1之间的相互作用,并揭示了 IRAK1参与病毒复制的分子机制以及证实mml-miR-146a在PRRSV的复制过程中发挥双重调控作用。以上研究结果以PRRSV nsp2、nspl0、nsp11与宿主细胞蛋白DDX18和IRAK1的相互作用为切入点,深入探究DDX18和IRAK1对病毒复制的影响,为阐明病毒的复制和致病机理提供科学依据。