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胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤,胃癌转移是胃癌患者死亡的重要原因。胃癌的侵袭、转移过程十分复杂,涉及到细胞外基质、血管形成等多个复杂的过程,这些与肿瘤转移有关的病理变化可以诱导肿瘤微环境发生变化,而肿瘤微环境又可以反过来促进肿瘤细胞的转移。肿瘤微环境是由细胞外基质、间质细胞等组成的,癌相关成纤维细胞(TAFs)是重要的间质细胞,其不仅可以通过细胞与细胞之间的相互作用诱导肿瘤转移还可以通过分泌多种细胞因子诱导肿瘤细胞的侵袭和迁移。环形RNA(circRNA)是一类功能比较特殊的非编码RNA,目前对其功能还未完全阐明。已知circRNA在哺乳动物体内表达,并且可以通过复杂的调控网络影响生命进程。circRNA能够通过与微小RNA(miRNA)结合而调控miRNA的表达,而miRNA又可以影响下游靶mRNA的表达,circRNA可以通过这种调控机制影响细胞的生长、侵袭等过程。以前的研究发现,circFAM188A在胃癌患者血浆中表达上调,circFAM188A可能参与胃癌进展。本次实验研究中探讨circFAM188A在与TAFs共培养的胃癌细胞生长和转移潜能中的作用和机制,并通过裸鼠移植瘤模型验证circFAM188A的作用。目的:本研究通过探讨circFAM188A调控miR-708-5p影响程序性死亡配体-1(PD-L1)表达对与TAFs共培养的胃癌细胞的增殖、克隆、细胞周期、侵袭、迁移和EMT的影响,并通过裸鼠移植瘤生长情况来证实,旨在明确circFAM188A在胃癌发展及转移中的作用机制。方法:1、分离培养TAFs和NFs,免疫荧光法检测α-SMA表达。2、TAFs和NFs分别与胃癌细胞共培养,MTT方法检测细胞增殖,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,PI单染法检测细胞周期分布变化,Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力变化,Western blot检测细胞中EMT相关蛋白Vimentin、N-cadherin、E-cadherin 的表达变化。3、qRT-PCR检测胃癌组织和胃癌细胞中及与TAFs共培养后circFAM188A、miR-708-5p及PD-L1的表达变化。4、在胃癌细胞中分别转染 circFAM188A siRNA、miR-708-5p inhibitor;circFAM188A siRNA、inhibitor control;miR-708-5p mimics、阴性对照载体和miR-708-5p mimics、PD-L1过表达载体与TAFs共培养后,检测各指标变化。5、starBase v2.0预测circFAM188A 与 miR-708-5p、PD-L1 与 miR-708-5p互为靶向关系,RIP实验和双荧光素酶报告系统鉴定它们的关系,RNA pull down实验验证其相互作用。6、在胃癌细胞中共转染 circFAM188A siRNA、inhibitor control 和circFAM188A siRNA、miR-708-5p inhibitor,与 TAFs 共培养后,Western blot检测细胞PD-L1蛋白变化。7、circFAM188A shRNA慢病毒载体转染胃癌细胞,接种至裸鼠皮下,观察裸鼠移植瘤生长体积和重量变化。取裸鼠移植瘤组织,qRT-PCR检测移植瘤组织中circFAM188A、miR-708-5p和PD-L1 1mRNA表达水平,Western blot检测移植瘤组织中PD-L1蛋白表达水平。结果:1、与NFs相比,TAFs中α-SMA表达水平较高;与TAFs共培养后的胃癌细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移能力均升高,G0/G1期细胞比例降低,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平升高,E-cadherin蛋白表达水平降低。2、circFAM188A、PD-L1在胃癌组织和细胞中高表达,circFAM188A高表达的患者预后不良,circFAM188A的表达水平与胃癌淋巴结转移、TNM分期、肿瘤大小有关。在与TAFs共培养后的胃癌细胞中表达水平升高。3、miR-708-5p在胃癌组织和细胞中表达下调,在与TAFs共培养的胃癌细胞中表达下调。4、circFAM188A与miR-708-5p互为靶向关系。miR-708-5p与PD-L1互为靶向关系。5、转染circFAM188A siRNA后的胃癌细胞与TAFs共培养,细胞增殖、克隆、侵袭、迁移能力降低,细胞G0/G1期比例升高,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平降低,E-cadherin蛋白表达水平升高,PD-L1蛋白表达水平降低。6、与共转染 circFAM188A siRNA、inhibitor control 相比,共转染 circFAM188A siRNA、miR-708-5p inhibitor后的胃癌细胞与TAFs共培养后,细胞增殖、克隆、侵袭、迁移能力升高,细胞G0/G1期比例降低,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平升高,E-cadherin蛋白表达水平降低,细胞中的PD-L1蛋白表达水平升高。7、与共转染miR-708-5p mimics、阴性对照载体相比,共转染miR-708-5p mimics、PD-L1过表达载体后的胃癌细胞与TAFs共培养后,细胞增殖、克隆、侵袭、迁移能力升高,细胞G0/G1期比例降低,Vimentin、N-cadherin蛋白表达水平升高,E-cadherin蛋白表达水平降低。8、circFAM188A shRNA慢病毒载体转染后的胃癌细胞裸鼠移植瘤生长体积和重量均降低;裸鼠移植瘤组织中circFAM188A和PD-L1水平降低,miR-708-5p 水平升高。结论:circFAM188A通过调控miR-708-5p影响PD-L1的表达来调节与TAFs共培养的胃癌细胞增殖、克隆、迁移、侵袭、细胞周期变化和上皮间质转化能力(EMT)。circFAM188A通过靶向miR-708-5p发挥作用,由此可见,circFAM188A可以作为胃癌的一个新的治疗靶点和潜在的早期胃癌筛查的生物学标记。同时本研究临床标本的检测结果表明circFAM188A高表达的胃癌患者预后不良,将来有望将circFAM188A作为监测胃癌患者预后的重要指标。