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目的：
探讨巴曲酶(Batroxobin)对视网膜色素上皮细胞(retinalpigmentepithelialcells,RPE)增殖活性的影响及玻璃体腔应用巴曲酶对兔视网膜组织形态和功能的影响，初步评价其应用于玻璃体手术中的可行性。
方法：
一、巴曲酶对RPE增殖活性的影响
利用体外培养的人视网膜色素上皮细胞系ARPE-19(ARPE-19，ATCC，catalog NoCRL-2302)，应用噻唑兰比色法(Methylthiazolyl-tetrazolium cellviabilityassay,MTT)及流式细胞术检测不同浓度的巴曲酶对RPE增殖活性的影响。
1.实验分组：
巴曲酶组：以无血清DF-12培养液(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium:NutrientMixtureF-12power,1:1，DF-12)溶解巴曲酶冻干粉至下列浓度
Ⅰ组.1/100、Ⅱ组.1/32、Ⅲ组.1/16、Ⅳ组.1/10、Ⅴ组.1/8(单位：KU·mL-1)
阴性对照组：无血清的DF-12培养液
阳性对照组：以无血清DF-12培养液溶解凝血酶(Thrombin)冻干粉至40U·mL-1
相应渗透压对照组：无血清DF-12加氯化钠调整渗透压至与各巴曲酶组相同
2.MTT检测巴曲酶对RPE增殖活性的影响
待细胞贴壁后以上述培养液置换含血清的培养液，继续培养24h，MTT处理后测定492nm波长处的吸光度(opticaldensity，OD)值。
3.流式细胞术检测巴曲酶对RPE增殖活性的影响
RPE细胞悬液中加入羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(5or6-(N-Succinimidyloxycarbonyl)-3,6-O,O-diacetylfluorescein，CFSE)作用10min，继续培养至细胞贴壁后以含不同浓度巴曲酶的培养基(1/100、1/32、1/16、1/10KU·mL-1)的置换原培养液，继续培养24h后使用流式细胞仪检测CFSE的荧光强度。
二、玻璃体腔灌注巴曲酶对兔眼内组织的影响
选取健康成年的新西兰大白兔24只，随机分为3组，每组8只，均以右眼为实验眼行经扁平部玻璃体切除术，术中应用含不同浓度巴曲酶的平衡盐溶液进行玻璃体腔灌注。其中A组(对照组)使用不含巴曲酶的无菌平衡盐溶液(balancedsaltsolution，BSS)；B组(低浓度组)使用巴曲酶浓度为1/100KU·mL-1的BSS；C组(高浓度组)使用巴曲酶浓度为1/10KU·mL-1的BSS。术后通过以下指标检测灌注液中添加的巴曲酶对视网膜组织的影响。
1.眼部一般体征的检查：术前、术后1d、3d、1w、4w以裂隙灯显微镜及双目间接检眼镜对各组动物行眼部一般体征检查。术前及术后1d、1w、4w以Tono-Pen测量各组动物眼压，观察眼压变化。
2.组织病理学检查：术后3d及4w，每组动物中随机各选取2只处死，眼球取材后经固定、脱水、透明、包埋、切片后，行苏木素.伊红染色。随机选取切片，观察视网膜形态改变。
3.透射电子显微镜检查：术后3d及4w，每组动物中随机各选取2只处死，眼球取材后经固定、脱水、浸透、包埋、半薄切片染色定位后，制作110nm超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后，透射电子显微镜下观察视网膜超微结构的改变。
4.闪光视网膜电图检查(flashelectroretinogram，fERG)：术后1w及4w，每组动物中随机选取4只，暗适应后分别行双眼fERG检查。每眼重复检查5次，分别记录fERG中双眼b波波幅；以右眼与左眼测量数值平均数的比值作为右眼视网膜功能的指标，比较各组间差异。
结果：
一、巴曲酶对RPE增殖活性的影响
当巴曲酶浓度不大于1/10KU·mL-1时，各浓度巴曲酶组(1/100、1/32、1/16、1/10KU·mL-1)与对照组OD值差异无统计学意义(P=0.068、0.455、0.675、0.159)；巴曲酶浓度为1/8KU·mL-1时OD值明显降低(P=0.000)。渗透压对照组OD值与培养液渗透压呈明确的负相关关系(Pearson相关系数=-0.951，P=0.000)；巴曲酶组和相应渗透压对照组OD值的差异无统计学意义(P=0.749)。MTT检测中RPE增殖未受影响的各实验组与对照组比较，CFSE荧光强度差异无统计学意义。
二、玻璃体腔灌注巴曲酶对兔眼视网膜组织的影响
1.术后早期各组动物均出现轻微的前节反应，观察的18眼中有16眼(88.9％)在一周内前房闪辉完全消失；术后1d、3d、1w、4w各组实验动物眼前节反应差异无统计学意义(P=0.975、0.516、0.588、1.000)。观察期间三组动物角膜及晶状体始终保持透明；玻璃体内未见明显混浊，眼底清晰，视网膜在位，无增生性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy，PVR)发生。各组术后各时间点眼压与自身术前测量值比较，差异均无统计学意义：术后1d:PA=0.564，PB=0.367，PC=0.611；术后1w:PA=0.880，PB=0.276，PC=0.227；术后4w:PA=0.394，PB=0.200，PC=0.324；
2.组织病理学：低浓度组术后3d和4w视网膜组织结构与对照组均无明显差异；高浓度组术后3d与对照组无明显差异，4w时可见视网膜局部有视细胞丢失、内外核层层次不清等改变。
3.透射电子显微镜：
低浓度组术后3d和4w视网膜组织结构超微结构均与对照组均无明显差异。
高浓度组术后3d外界膜与外颗粒层之间见大量脂滴存在。外节轻稀疏，外颗粒层高度较正常略低，视细胞核大小欠均匀，可见轻度核染色质皱缩。4w时视网膜局部病灶区域超微结构变化明显，RPE高低不均，线粒体肿胀。外节排列稀疏有异常变性的表现。内节高度明显降低，外界膜不甚清晰。外颗粒层细胞胞核大小不均，视细胞核染色质稀疏皱缩，可见部分视细胞核脱落。其余区域视网膜超微结构与对照组差异不明显。
4.闪光视网膜电图检查：术后各时间点各组fERG检查双眼暗适应b波波幅的比值差异无统计学意义(1w:PA=0.101、PB=0.480、PC=0.394；4w:PA=0.963、PB=0.671、PC=0.410)。
结论：
一、渗透压符合RPE生长要求的前提下，巴曲酶对体外培养的视网膜色素上皮细胞增殖无明显影响，但随着药物浓度增加而呈线性增加的渗透压使其眼内应用的可能浓度范围受到了限制。
二、在兔玻璃体腔灌注添加不同浓度巴曲酶的灌注液不会引起明显的术后炎症反应及眼压变化，不会导致PVR的形成。低浓度巴曲酶灌注对视网膜结构和功能无明显影响；灌注浓度达1/10KU·mL-1时可以造成视网膜局灶性视细胞丢失。fERG检查各组间差异无统计学意义。