论文部分内容阅读
杆状病毒是研究大ds DNA病毒进化和多样性的模型之一，随着杆状病毒全基因组序列的增加和比较基因组学、系统进化学以及生物信息学的发展，对杆状病毒基因组结构和进化研究都取得很大进步。甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mamestra brassciae multiple nucleopolyhedrovirus，MabrMNPV)作为一种具有广谱宿主范围的杆状病毒，在我国已被用于农林害虫的生物防治。本文对MabrMNPV进行全基因组测序，并从基因组和比较基因组两方面对其序列进行生物信息学分析。MabrMNPV基因组信息也能够为杆状病毒的基因组结构和进化提供线索和证据。通过与其他杆状病毒基因组的比较，能够更好地理解杆状病毒的多样性。另外，MabrMNPV基因组信息对于未来改造病毒使其杀虫活性提高，增强生物杀虫的效应提供分子上的指导。本研究主要内容包括：
⑴虫体克隆获得MabrMNPV分离株，对其生物学进行初步研究。采用虫体克隆的方法，得到了一株MabrMNPV，命名为MabrMNPV-CHb1。透射电镜观察显示MabrMNPV-CHb1包涵体外形呈不规则的多边形;每个包涵体中含有多个杆状病毒病毒粒子，每个病毒粒子中含有多个核衣壳，验证了MabrMNPV-CHb1确实为多粒包埋型的杆状病毒。对MabrMNPV-CHb1的酶切图谱分析表明，其与从荷兰分离的MabrMNPV的酶切图谱有一定的差异，说明了两种病毒基因组中存在差异。虽然已有文献对MabrMNPV-CHb1的宿主范围进行了详细的研究，但并无文献报道其对昆虫细胞的允许性进行研究，本文研究了MabrMNPV-CHb1对Sf9、Tn368和Hz-AM1细胞的感染性表明Sf9和Tn368细胞是MabrMNPV-CHb1的允许性细胞，MabrMNPV-CHb1能在细胞内形成多角体，但是MabrMNPV-CHb1不能在Hz-AM1细胞中形成多角体，也不能引起细胞病变，推测其可能不能进入Hz-AM1细胞，或者能够进入Hz-AM1细胞，但是不能在其内复制，也有可能MabrMNPV-CHb1在Hz-AM1细胞内形成潜伏感染。
⑵MabrMNPV-CHb1基因组全序列分析。用454高通量测序技术测定了MabrMNPV-CHb1的全基因组，生物信息学分析表明:MbMPNV-CHb1基因组全长为154451 bp，G+C含量为40.05％;预测ORFs共有120个，编码区域占整个基因组的91.2％，其中与polh基因具有相同转录方向ORFs有85个，与其转录反向的ORFs有77个;MabrMNPV-CHb1基因组结构中存在着基因间隔区，同源重复序列，基因重叠和基因重复的现象，其中含有4个同源重复区hrs，6个bros基因，还有6个基因各含两个拷贝，包括odv-e66, p26, chtB1/2，xe，orf52，比对分析表明每个基因的两个拷贝分别从不同来源获得。MabrMNPV-CHb1基因组中含有所有杆状病毒的37种核心基因和26种辅助基因，基因组中的基因编码的产物参与病毒DNA复制及基因转录，病毒结构包装和释放，口服感染，影响宿主代谢等，另外还有60个orfs功能未知。MabrMNPV-CHb1基因组进化研究表明:MabrMNPV-CHb1基因组与HearMNPV、MacoMNPV-B、MacoMNPV-A、 SpexMNPV、SpfrMNPV和AgSpexMNPV等基因组在LCBs数目，长度和方向上具有非常高的一致性;另外，MabrMNPV-CHb1与AcMNPV、XecnGV和CuniNPV的LCBs具有很大差异，其中与CuniNPV的差异性最大。
⑶MabrMNPV-CHb1与HearMNPV和MacoMNPV-B比较基因组学。对三种病毒的基因组结构，序列和进化进行比较分析发现，MabrMNPV-CHb1与HearMNPV和MacoMNPV-B的基因组全序列相似性分别都达到了98％。三种病毒的基因排列不但共线性，且基因的相似度极高，MabrMNPV-CHb1与HearMNPV的平均氨基酸相似性为99.1％，与MacoMNPV-B的平均氨基酸相似性为98.8％。MabrMNPV-CHb1和HearMNPV由于缺失一个5.4 kb的大片段，因此在基因组大小分别比MacoMNPV-B病毒小4031 bp和4286bp。三者病毒的基因组的差异主要集中在hrs，bro基因群，MabrMNPV-CHb1的orf133基因，orf17基因，HearMNPV的orf139基因及5.4 kb的大基因簇缺失。