目的在观察胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠相关炎性细胞因子昼夜节律特点的基础上,进一步观察TG对CIA大鼠炎性因子昼夜节律的影响以及甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)、来氟米特(leflunomide,LEF)、TG对CIA大鼠时间治疗作用及其机制,为临床的应用提供实验室依据。方法1实验分组及处理1.1第一部分:雌性Wistar大鼠80只置于时间生物学实验室,固定光照(L)∶黑暗(D)时间(L∶D=12∶12,明期为07:00~19:00,暗期为19:00~07:00)。将80只随机分入空白组30只,模型组50只。适应饲养10天后建立CIA模型,观察造模21d后,记录成模大鼠踝关节和足爪肿胀度。第42d,分别于授时时间(zeitgeber time,ZT,以ZT0为光照开始)ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18、ZT22,6个不同时间点分别平均处死大鼠,采血、留取病变关节。1.2第二部分:雌性Wistar大鼠120只置于时间生物学实验室,固定光照(L)∶黑暗(D)时间(L∶D=12∶12,明期为07:00~19:00,暗期为19:00~07:00),自由摄食饮水。将60只大鼠按照大鼠药物干预时间不同,分为授时时间TG-ZT6组与TG-ZT18组,每组60只。适应饲养10天后建立CIA模型,观察造模21d后,选取成模CIA大鼠开始进行药物干预,TG组灌胃(40mg/kg),每日给药。记录大鼠踝关节和足爪肿胀度。药物干预42d,分别于ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18、ZT22,6个不同时间点分别平均处死大鼠,采血、留取病变关节。1.3第三部分:雌性Wistar大鼠120只置于时间生物学实验室,固定光照(L)∶黑暗(D)时间(L∶D=12∶12,明期为07:00~19:00,暗期为19:00~07:00)。随机将标记大鼠分入空白组8只,模型组16只,雷公藤多苷组(TG)32只,甲氨蝶呤组(MTX)32只,来氟米特组(LEF)32只。适应饲养10d后建立CIA模型,观察造模21d后,选取成模CIA大鼠开始进行药物干预,MTX组灌胃(0.1mg/kg),TG组灌胃(40mg/kg),LEF组灌胃(2mg/kg),空白组与模型组均以等量3%羧甲基纤维素钠灌胃。MTX隔日给药,其余药物均为1/日,持续给药42d。记录CIA模型大鼠踝关节和足爪肿胀度。干预结束后,采血、留取病变关节。2实验方法2.1每3d使用游标卡尺法测量大鼠踝关节直径和足爪厚度。2.2 ELISA方法检测大鼠血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)及白介素-17a(interleukin-17a,IL-17a)表达水平。2.3免疫组织化学方法检测病变关节滑膜细胞IL-6、IL-17a、基质金属蛋白酶-3(matrix matallprotein-3,MMP-3)、TNF-α、CLOCK及BMAL1表达水平;显微镜下观察组织病理形态。2.4药物干预41d拍双足爪X线正位片,观察影像学进展。2.5各组正态分布计量资料数据均采用均数±标准((?)±s)差表示。组间差异采用多样本均数的方差分析进行判断,两两均数比较采用t检验进行判断。检验水准α=0.05。结果1 CIA大鼠相关炎性因子昼夜节律特点1.1各组大鼠踝关节肿胀度变化CIA大鼠随着造模时间的延长,关节肿胀度呈现先逐渐增加,后缓慢降低的趋势。模型组CIA大鼠初次免疫33d时,踝关节肿胀最为严重;初次免疫39d时,掌指关节肿胀最为严重。1.2CIA大鼠模型血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各个时间点CIA大鼠模型血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各不相同。空白组大鼠一昼夜内IL-17a、IL-6及TNF-α血清水平稳定;IL-17a、IL-6及TNF-α三种炎性因子在一昼夜内呈现相近的波动特点:夜晚血清含量水平升高,白天血清水平降低。其中IL-17a在ZT18开始上升,并且于ZT22达到峰值;在ZT2开始下降,并且于ZT6达到谷值。IL-6在ZT14开始上升,并且于ZT22达到峰值;在ZT2开始下降,并且于ZT6进入平台期。TNF-α在ZT14开始上升,并且于ZT22达到峰值;在ZT2开始下降,并且于ZT6进入谷值。1.3各组CIA大鼠踝关节X线观察各组大鼠踝关节X线摄片结果差异较大。其中空白组大鼠踝关节X线观察踝关节关节面清晰,掌指关节骨皮质完整,关节间隙未见异常。模型组CIA大鼠踝关节关节面模糊,骨缺损明显,掌指关节可见大块骨缺损,关节间隙改变。1.4各组CIA大鼠踝关节HE染色及免疫组织化学观察空白组大鼠踝关节HE染色可见滑膜平滑,1-2层滑膜细胞,无乳突状突起或增生,未见多核细胞浸润。模型组CIA大鼠踝关节HE染色可见滑膜细胞增生严重,乳突状凸起,大量炎细胞浸润。通过免疫组织化学检测观察发现模型组大鼠滑膜细胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表达量均明显高于空白组表达。2雷公藤多苷对CIA大鼠相关炎性因子昼夜节律的影响2.1各组CIA大鼠关节肿胀度值变化干预42d各组CIA大鼠关节肿胀度变化各不相同,随着造模时间的延长,CIA大鼠关节肿胀度逐渐增加。两时间治疗组相比较,观察第42d TG-ZT18组踝关节直径及足爪厚度肿胀抑制程度显著优于TG-ZT6组(P<0.05),在持续观察时间内,TG-ZT18足爪厚度变化曲线始终位于TG-ZT6组曲线之下。2.2各组CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量干预42d各时间治疗组CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各不相同。与TG-ZT6组比较,TG-ZT18组血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明显降低(P<0.05)。2.3各组CIA大鼠踝关节X线观察两组大鼠踝关节X线摄片结果有明显不同。TG-ZT6组CIA大鼠踝关节关节破坏,关节面模糊,部分关节可见骨缺损。TG-ZT18组CIA大鼠踝关节关节面尚可见,左足改变较轻,少部分掌指关节骨破坏,关节间隙轻度改变。2.4各组CIA大鼠踝关节HE染色及免疫组织化学观察TG-ZT6组CIA大鼠踝关节HE染色可见滑膜细胞增生,乳突状凸起,大量炎细胞浸润;TG-ZT18组CIA大鼠踝关节HE染色可见滑膜细胞增生较轻,乳突状凸起,少量炎细胞浸润。免疫组织化学检测观察发现TG-ZT18组大鼠滑膜细胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表达量均明显高于TG-ZT6组表达。3 MTX、LEF和TG对CIA大鼠时间治疗及其机制3.1各组CIA大鼠踝关节肿胀度值变化干预42d各组CIA大鼠关节肿胀度变化各不相同。与模型组相比较,MTX组、LEF组及TG组肿胀度均明显下降(P<0.05);其中踝关节肿胀度以MTX下降最为明显,足爪厚度以LEF组下降最为明显。干预第42d MTX-ZT18组肿胀度明显低于MTX-ZT 6组(P<0.05),干预第21d之后MTX-ZT 18组整体肿胀度曲线在MTX-ZT 6之下;干预第42d,与TG-ZT 6组相比较,TG-ZT 18组肿胀度也显著降低(P<0.05),但是TG-ZT 6组起效较慢,而TG-ZT 18组变化趋势整体在TG-ZT6组之下;干预第42d,LEF-ZT 6组与LEF-ZT18组相比较,无显著差异(P>0.05)。3.2各组CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量干预42d各时间治疗组CIA大鼠血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量各不相同。与模型组比较,两MTX时间治疗组血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量均显著下降(P<0.05);与MTX-ZT6比较,MTX-ZT18组血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明显降低(P<0.05)。与模型组比较,两LEF时间治疗组血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量均显著下降(P<0.05),与LEF-ZT6组相比较,LEF-ZT18组血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量均无显著差异(P>0.05)。与模型组比较,TG-ZT18组血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明显下降(P<0.05),TG-ZT6组与模型组相比较血清IL-6与TNF-α含量明显降低(P<0.05),血清IL-17a水平却与模型组比较无显著差异(P>0.05);与TG-ZT6组比较,TG-ZT18组血清IL-17a、IL-6及TNF-α含量明显降低(P<0.05)。3.3各组大鼠踝关节X线摄片各组大鼠踝关节X线摄片结果差异较大。其中正常组大鼠踝关节X线观察踝关节关节面清晰,掌指关节骨皮质完整,关节间隙未见异常。模型组CIA踝关节关节面模糊,骨缺损明显,掌指关节可见大块骨缺损,关节间隙改变。MTX-ZT6组CIA大鼠踝关节关节破坏,关节面模糊,部分掌指关节可见骨缺损。MTX-ZT18组CIA大鼠踝关节关节面尚可见,左足改变较轻,少部分掌指关节骨破坏,关节间隙轻度改变。LEF-ZT6组与LEF-ZT18组CIA大鼠踝关节关节面均可见,未见明显骨破坏。TG-ZT6组CIA大鼠踝关节关节破坏,关节面模糊,部分关节可见骨缺损。TG-ZT18组CIA大鼠踝关节关节面尚可见,左足改变较轻,少部分掌指关节骨破坏,关节间隙轻度改变。3.4各组CIA大鼠踝关节HE染色及免疫组织化学观察空白组大鼠踝关节HE染色可见滑膜平滑,1-2层滑膜细胞,无乳突状突起或增生,未见多核细胞浸润。模型组CIA大鼠踝关节HE染色可见滑膜细胞增生严重,乳突状凸起,大量炎细胞浸润。TG组、LEF组和MTX组CIA大鼠踝关节HE染色可见滑膜细胞均有不同程度增生和炎细胞浸润;同时TG-ZT18、LEF-ZT18、MTX-ZT18组分别与TG-ZT6、LEF-ZT6、MTX-ZT6比较滑膜细胞增生均较轻和炎细胞浸润减少。免疫组织化学检测大鼠踝关节观察发现模型组大鼠滑膜细胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表达水平均明显高于空白组;TG组、LEF组和MTX组CIA大鼠踝关节滑膜细胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表达水平与模型组相比较明显降低;同时TG-ZT18、LEF-ZT18、MTX-ZT18组分别与TG-ZT6、LEF-ZT6、MTX-ZT6比较滑膜细胞IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3、CLOCK及BMAL1表达量均有不同程度下降。结论1 CIA大鼠血清IL-17a、IL-6和TNF-α均于ZT22到达峰值,ZT6到达谷值一昼夜内呈动态变化。2 TG、LEF和MTX在炎症上升期干预可以更加有效抑制炎症,减缓病情。3 TG、LEF和MTX可能通过影响CLOCK/BAML1时钟基因的表达,直接/间接影响IL-17a、IL-6、TNF-α、MMP-3的水平,从而起到抗炎的作用。