【摘 要】
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为了研究人绒毛膜促性腺激素(HCG)在大肠杆菌中的表达,本课题主要利用PGEX-4T-1载体来构建PGEX-4T-1-HCG重组质粒,重组质粒构建成功后,将重组质粒导入到大肠杆菌BL21中进行表
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为了研究人绒毛膜促性腺激素(HCG)在大肠杆菌中的表达,本课题主要利用PGEX-4T-1载体来构建PGEX-4T-1-HCG重组质粒,重组质粒构建成功后,将重组质粒导入到大肠杆菌BL21中进行表达,研究其表达能力。首先我们利用DNA提取试剂盒分别对购买来的菌液提取PGEX-4T-1以及HCG基因的质粒。在HCG中找到我们最需要的一段基因序列,将本段基因序列以HCG作为模板,利用PCR技术扩增出来,设计上下游引物时加入限制内切酶SalⅠ和BglⅡ酶切点。对纯化后的PCR产物进行SalⅠ和BglⅡ进行双酶切,得到的酶切产物具有和载体相同的粘性末端。然后再将PGEX-4T-1载体用不同的酶进行酶切,与HCG酶切产物具有相同粘性末端的酶切产物进行连接,构建出重组质粒,将重组质粒命名为PGEX-4T-1-HCG,将连接好的PGEX-4T-1-HCG重组质粒利用氯化钙转化法,转化入大肠杆菌BL21(DE3)内,然后涂布LB抗性固体培养基上,此培养基加入了终浓度100μg/m L的氨苄青霉素,然后放到37℃培养箱中过夜培养,筛选出阳性菌落。对所提的质粒即重组质粒进行双酶切鉴定,然后PCR鉴定。最后将这些重组质粒进行测序检测,经过序列分析证实基因序列符合要求,重组质粒构建成功。构建成功的重组质粒经鉴定命名为PGEX-4T-1-HCG,重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中,通过IPTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)诱导表达。基因表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,经过电泳分析,所表达的目标蛋白37 KD,与预期分子量相符。经过单因素试验,对大肠杆菌表达条件中,培养基成分,培养温度,培养时间,IPTG浓度和菌体浓度等条件的优化,来提高目的蛋白的产量。
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