本论文以链霉菌一些新的线型质粒和环型质粒为对象开展了DNA复制等方面的研究，在此基础上建立了新的大片段DNA的遗传操作系统，具体内容包括以下几个部分：　　 1、链霉菌线型质粒新的端粒、末端蛋白和复制基因的研究。前人发现的链霉菌线型质粒和线型染色体一般都含有保守的端粒序列，相对应结合在端粒序列上的末端结合蛋白和末端蛋白也具有保守序列。线型质粒的“中心”复制区一般为一段非编码的重复序列和邻近的一个或两个复制基因。我们建立了一个PCR的方法，来检测链霉菌群体中是否存在保守的端粒序列以及对应的端粒复制基因。在100株链霉菌中检测到17株含有线型质粒，其中有8株没有典型的端粒复制基因的序列。从这8株菌中选取了两个线型质粒pRL1和pRL2,，在预测有保守端粒的菌株中选取了一个线型质粒pFRL1，分别克隆了它们的端粒。序列测定显示，前两者的端粒在序列上确实与后者的保守型端粒不同，但是都含有多个短的回文序列。质粒全序列分析显示，pRL2上有一个基因，它编码的蛋白含有两个结构域，分别与链霉菌的Tpg蛋白和硫杆菌的解旋酶相似，它邻近的一个基因编码的蛋白与链霉菌的Tpg蛋白和腺病毒端粒的末端蛋白pTP的一部分相似。　　 2、链霉菌线型质粒多样化的复制区的研究。链霉菌线型质粒的复制一般从位于其“中心位置”的复制起始位点开始，基本复制区一般包括iteron和它附近的复制基因。在本实验中，我们从5个线型质粒中鉴定了7个基本复制区。pRL2上基本复制区由一段非连续的区域构成，包括2个复制基因——2个非复制必需基因——一段iteron。质粒含有这一区域可以进行环型复制，也可以线型复制。温敏的线型质粒pRL4的复制区包括一段非编码区和一个与SAP1相似的基因。pFRL2的复制区包括紧靠端粒的一个基因和一段非编码序列，这个基因编码的蛋白与SAP1.1蛋白非常相似。在鉴定SAP1的复制区的时候，与预测的一样：它有两个复制区，分别位于端粒处和质粒的中心位置。与SAP1类似，在线型质粒pFRL1上也含有靠近端粒的复制区和位于质粒中部的2个复制区。　　 3、链霉菌大的环型质粒的复制区的研究。许多链霉菌不仅含有线型质粒，还含有环型质粒。我们鉴定了两个新发现的较大的环型质粒pFP11和pFP1。它们的基本复制区均包括一个复制基因和附近的iteron序列，这与一些线型质粒中的基本复制区的构成相似。在体外的蛋白-DNA结合实验中证明复制蛋白特异地结合到iteron序列上。它们均以非滚环方式进行复制。含有pFP11的最小复制区的质粒在遗传上是十分不稳定的，par基因和它附近的区域对增加它的稳定性有重要的作用。　　 4、链霉菌环型质粒和线型质粒复制的比较和可能的进化关系。鉴于环型质粒pFP11和pFP1的复制区的组成与链霉菌线型质粒的非常相似，我们将它们的复制区克隆到有两个pSLA2端粒的载体上时，发现携带pFP11复制区的质粒能够在变铅青链霉菌中进行稳定的线型复制，而pFP1的则不能。随后测试了更多的链霉菌环型质粒是否具有复制成线型DNA的能力，包括天蓝色链霉菌的SCP2和整合型质粒SLP1，以及变铅青链霉菌的pIJ101。结果显示SCP2的复制区加上端粒后也能够进行线型复制，而pIJ101或SLP1的则不能。由于链霉菌线型质粒的复制模式是双向复制，这些结果暗示了pFP11和SCP2是双向复制的。在遗传稳定性实验中，线型复制的质粒的稳定性比环型复制质粒的稳定性要高出100倍左右。当我们把任意两个环型质粒的复制区构建在一个载体上时，它们在链霉菌中是不能以环型方式存在的，但是当两端加上线型质粒的端粒时，它们是可以以线型方式复制存在的。上面这些结果说明，在链霉菌中一些环型质粒与线型质粒之间可能具有亲缘关系，不过线型复制比环型复制更稳定遗传，因而可能具有进化上的优越性。　　 5、以天蓝色链霉菌线型质粒SCP1为基础发展按顺序的连续同源重组克隆大片段DNA的技术。我们建立了体内重组克隆的方法，这种按顺序的连续同源重组的方法理论上可以克隆任意宿主中的任意长度的抗生素生物合成基因簇。实验中我们以天蓝色链霉菌中天然的356 kb的线型质粒SCP1为基本载体，在敲除了右臂一段非生长必需的DNA序列后，以包含目的基因簇的重叠排列的cosmid为基本单元，利用体内同源重组的方法，逐步将整个基因簇递加重组到线型质粒上。利用这个方法我们克隆了放线紫红素，阿维菌素，寡霉素和多杀菌素等的全长的抗生素生物合成基因簇。　　 6、利用环型质粒可分离的复制元件建立体内同源重组克隆抗生素生物合成基因簇的方法。前期的工作表明，环型质粒pFP11复制区的二个基本原件是可以被其它基因隔开的。利用此特点，结合富集/筛选方法，我们建立了体内强迫重组克隆大片段DNA的方法。具体包括在要克隆的抗生素生物合成基因簇上加上筛选标记和环型质粒复制区中的iteron，另一方面构建载体携带该基因簇两末端的同源序列、质粒接合转移的基因tra、复制基因rep以及另一个筛选标记，并导入带有整合iteron的菌株中，以实现“体内强迫重组”。之后，通过质粒高频率的接合转移，将携带抗生素基因簇、rep、iteron、tra的“环出”质粒在变铅青链霉菌中选择出来。利用该方法，我们尝试克隆了除虫链霉菌的阿维菌素生物合成基因簇。　　 前人发现的链霉菌线型质粒和线型染色体一般都含有保守的端粒序列，相对应结合在端粒序列上的末端结合蛋白和末端蛋白也具有保守序列。线型质粒的“中心”复制区一般为一段非编码的重复序列和邻近的一个或两个复制基因。我们建立了一个PCR的方法，来检测链霉菌群体中是否存在保守的端粒序列以及对应的端粒复制基因。　　 链霉菌线型质粒的复制一般从位于其“中心位置”的复制起始位点开始，基本复制区一般包括iteron和它附近的复制基因。在本实验中，我们从5个线型质粒中鉴定了7个基本复制区。pRL2上基本复制区由一段非连续的区域构成，包括2个复制基因—2个非复制必需基因——一段iteron。质粒含有这一区域可以进行环型复制，也可以线型复制。温敏的线型质粒pRL4的复制区包括一段非编码区和一个与SAP1相似的基因。pFRL2的复制区包括紧靠端粒的一个基因和一段非编码序列，这个基因编码的蛋白与SAP1.1蛋白非常相似。在鉴定SAP1的复制区的时候，与跟预测的一样：它有两个复制区，分别位于端粒处和质粒的中心位置。　　 许多链霉菌不仅含有线型质粒，还含有环型质粒。我们鉴定了两个新发现的较大的环型质粒pFP11和pFP1。它们的基本复制区均包括一个复制基因和附近的iteron序列，这与一些线型质粒中的基本复制区的构成相似。在体外的蛋白-DNA结合实验中证明复制蛋白特异地结合到iteron序列上。Southern杂交未能检测到单链DNA，暗示它们以非滚环方式进行复制。含有pFP11的最小复制区的质粒在遗传上是十分不稳定的，par基因和它附近的区域对增加它的稳定性有重要的作用。　　 鉴于环型质粒pFP11和pFP1的复制区的组成与链霉菌线型质粒的相似，我们将它们的复制区克隆到有两个pSLA2端粒的载体上时，发现携带pFP11复制区的质粒能够在变铅青链霉菌中进行稳定的线型复制，而pFP1的则不能。随后测试了更多的链霉菌环型质粒是否具有复制成线型DNA的能力，包括天蓝色链霉菌的SCP2和整合型质粒SLP1，以及变铅青链霉菌的pIJ101。结果显示SCP2的复制区加上端粒后也能够进行线型复制，而pIJ101或SLP1的则不能。由于链霉菌线型质粒的复制模式是双向复制，这些结果暗示了pFP11和SCP2是双向复制的。在遗传稳定性实验中，线型复制的质粒的稳定性比环型复制质粒的稳定性要高出100倍左右。当我们把任意两个环型质粒的复制区构建在一个载体上时，它们在链霉菌中是不能以环型方式存在的，但是当两端加上线型质粒的端粒时，它们是可以以线型方式复制存在的。上面这些结果说明，在链霉菌中一些环型质粒与线型质粒之间可能具有亲缘关系，不过线型复制比环型复制更稳定遗传，因而可能具有进化上的优越性。　　 我们建立了体内重组克隆的方法，这种按顺序的连续同源重组的方法理论上可以克隆任意宿主中的任意长度的抗生素生物合成基因簇。实验中我们以天蓝色链霉菌中天然的356 kb的线型质粒SCP1为基本载体，在敲除了右臂一段非生长必需的基因后，以包含目的基因簇的重叠排列的cosmid为基本单元，利用体内同源重组的方法，逐步将整个基因簇递加重组到线型质粒上。利用这个方法我们克隆了放线紫红素，阿维菌素，寡霉素和多杀菌素等的全长的抗生素生物合成基因簇。不过所克隆的这些基因簇在后期的异源表达中遇到了困难。　　 在本章中我们利用环型质粒可分离的复制元件建立了内同源重组克隆抗生素生物合成基因簇的方法。前期的工作表明，环型质粒pFP11复制区的两个基本元件是可以被其它基因分隔开的。利用此特点，结合富集/筛选方法，我们建立了体内强迫重组克隆大片段DNA的方法。具体包括在要克隆的抗生素生物合成基因簇上加上筛选标记和环型质粒复制区中的iteron，另一方面构建载体，携带该基因簇两末端的同源序列、质粒接合转移的基因tra、复制蛋白基因rep以及另一个筛选标记，并导入带有整合iteron的菌株中，以实现“体内强迫重组”。之后，通过质粒高频率的接合转移，将携带抗生素基因簇、rep、iteron、tra的“环出”质粒在变铅青链霉菌中选择出来。利用该方法，我们尝试克隆了除虫链霉菌的阿维菌素生物合成基因簇。