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肥胖症患者伴有的体内炎症介质水平上升,是其罹患慢性非传染性疾病的重要危险因素。为了预防和治疗肥胖相关慢性疾病,首先需要改善机体低度慢性炎症状态。酪蛋白糖巨肽(casein glycomacropeptide,GMP),是一种来源于κ-酪蛋白并具有多种生理活性的C-末端亲水性糖肽,能够降低肥胖大鼠体重和血脂水平,对肥胖大鼠机体的炎症状态有一定的改善作用。本研究以RAW264.7巨噬细胞和3T3-L1前脂肪细胞作为细胞研究模型,选取碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶分别酶解GMP,筛选获得具有良好抗炎活性的GMP酶解产物,并对其抗炎机制进行深入研究,为将GMP及其酶解产物作为功能乳基料用于早期营养干预肥胖及相关慢性炎症疾病提供了理论基础和科学依据。本研究利用脂多糖(LPS)刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞建立炎症反应模型,评价GMP及其酶解产物对LPS刺激巨噬细胞炎症反应的影响。结果表明,GMP经木瓜蛋白酶作用1h后所得的酶解产物(命名为:酪蛋白糖肽)对LPS刺激巨噬细胞TNF-α mRNA表达和NO生成具有最强的抑制作用。同时,酪蛋白糖肽显著抑制LPS刺激RAW264.7巨噬细胞内TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8及iNOSmRNA表达,并呈浓度依赖效应。此外,建立H2O2诱导RAW264.7巨噬细胞氧化损伤模型,评价酪蛋白糖肽的体外抗氧化活性。结果发现酪蛋白糖肽通过提高机体内源性抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性,减少细胞内ROS积累,缓解H2O2诱导RAW264.7细胞的脂质过氧化和蛋白质羰基化,降低细胞凋亡水平。本研究进一步评价了酪蛋白糖肽抑制巨噬细胞炎症反应的分子机制,研究酪蛋白糖肽对LPS刺激巨噬细胞内炎症信号通路激活的影响。结果表明,酪蛋白糖肽通过阻碍LPS与TLR4结合,下调TLR4基因和蛋白表达,抑制RAW264.7细胞表面TLR4的信号活化,进一步抑制下游IKKβ/IκBα/NF-κB的信号转导路径激活,从而缓解巨噬细胞炎症反应。此外,酪蛋白糖肽可以下调LPS刺激RAW264.7巨噬细胞内ROS水平和提高细胞内还原型GSH含量,显著降低LPS刺激RAW264.7巨噬细胞NOX2基因和蛋白表达,抑制外源ROS诱导的NF-κB活化,表明酪蛋白糖肽可通过缓解LPS刺激RAW264.7巨噬细胞内氧化还原状态失衡,抑制ROS介导的NF-κB活化发挥其抗炎效应。为了明确Nrf2/HO-1途径在酪蛋白糖肽抑制巨噬细胞炎症反应中的作用,本研究利用HO-1特异性抑制剂ZnPPIX和酪蛋白糖肽共同干预LPS刺激RAW264.7巨噬细胞炎症反应模型。结果表明,酪蛋白糖肽对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞内炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS)和NOX2基因表达、ROS生成及NF-κB核移位的抑制作用可部分被ZnPPIX处理逆转。此外,酪蛋白糖肽通过诱导RAW264.7巨噬细胞Nrf2核移位,促进细胞内HO-1表达。添加ROS清除剂NAC、P13K抑制剂LY29400、ERK抑制剂PD98059和p38抑制剂SB203580均能显著下调细胞HO-1表达和细胞核Nrf2水平,表明酪蛋白糖肽诱导RAW264.7巨噬细胞HO-1表达依赖于细胞内ROS信号以及P13K/Akt和MAPKs(ERK1/2和p38)信号通路激活。最后,建立小鼠RAW264.7巨噬细胞与成熟脂肪细胞条件培养基共培养体系,体外模拟脂肪组织微环境,初步评价酪蛋白糖肽对脂肪组织炎症的干预效果。结果表明,与GMP相比,酪蛋白糖肽对巨噬细胞条件培养基(MΦ-CM)诱导3T3-L1脂肪细胞炎症因子(TNF-α、IL-1β、iNOS、MCP-1)基因表达的抑制效果更显著。并且,酪蛋白糖肽还可显著抑制脂肪细胞条件培养基(3T3-CM)诱导的RAW264.7巨噬细胞活化,下调细胞内炎症因子(TNF-α、IL-1β、iNOS、MCP-I)基因表达。脂肪组织炎症反应与细胞内TLR4高表达有关,酪蛋白糖肽通过抑制细胞TLR4mRNA表达,有效缓解条件培养基共培养体系下脂肪细胞和巨噬细胞炎症反应。