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由柄锈菌(Puccinia helianthi Schw.)引起的向日葵锈病是发生在向日葵上重要的真菌病害之一,严重时会影响品质及含油量。MicroRNA(miRNA)是植物体内普遍存在的一种非编码单链小RNA,参与调控植物生长发育及多种逆境胁迫响应。针对向日葵抗病相关miRNA这一研究的空白,本试验构建锈病胁迫下向日葵small RNA文库,通过Solexa高通量测序及生物信息学分析筛选与抗病显著相关的miRNA;利用实时荧光定量(qRT-PCR)技术对10个抗病相关的miRNA进行定量验证,并利用miRanda软件进行靶基因预测;挑选其中的4个抗病相关的miRNA构建miRNA的植物表达载体。这为深入研究向日葵miRNA抗病分子机制及进一步研究向日葵抗病相关miRNA的功能奠定基础。主要研究结果如下:1.用高通量测序技术预测分析了向日葵miRNA,在其全基因组中共发现了 378个miRNA,其中373个是新发现的miRNA,新预测的miRNA中有13个miRNA是对照组(A)、抗病组(B)、感病组(C)三组材料中差异表达的。样品A和样品B之间共有8个差异表达基因,样品B和样品C之间共有3个差异表达基因,样品C和样品A之间共有2个差异表达基因。2.挑选其中10个(筛除A-VS-C中差异表达的2个miRNA基因,考虑与本实验抗病相关miRNA的研究关联较小;筛除另外1个差异表达的miRNA因为其对应的靶基因较少)差异表达的miRNA(Han-miR11、Han-miR21、Han-miR22、Han-miR25、Han-miR34、Han-miR42、Han-miR43、Han-miR45、Han-miR47、Han-miR67)进行qRT-PCR验证,结果与前期高通量测序结果80%相一致。3.用miRanda软件(3.3a)对13个差异表达miRNA。的靶基因进行预测并注释,13个差异表达的miRNA共预测到155个靶基因,每个miRNA均对应多个靶基因,其中一小部分靶基因功能未知,有122个靶基因获得其功能注释。4.将13个差异表达miRNA的靶基因(共128个)用GO做功能分类,结果表明:“ADP结合活性(ADP binding)”和“嘌呤核苷结合活性(Purine nucleoside binding)、核苷结合活性(Nucleoside binding)、嘌呤核糖核苷酸结合活性(Purine ribonucleotide binding)、核糖核苷结合活性(Ribonucleoside binding)、嘌呤核糖核苷结合活性(Purine ribonucleoside binding)、嘌呤核苷酸结合活性(Purine nucleotide binding)”是分子功能中显著富集的GO term;“应激反应(Response to stress)、防御反应(Defense response)”是生物学过程中显著富集的GO term。5.对13个差异表达miRNA的靶基因用KEGG通路注释和显著性富集分析,结果显示,在样品A和样品B(B-VS-A)、样品B和样品C(B-VS-C)、样品C和样品A(C-VS-A)中,分别有30、17、6个unigene参与到物质代谢、有机系统、遗传信息处理、环境信息处理、细胞学过程五类生化代谢途径中。在B-VS-A中,差异表达基因的靶基因共有38个注释到33个通路,B-VS-C中,差异表达基因的靶基因共有26个注释到23个通路,C-VS-A中,差异表达基因的靶基因共有7个注释到5个通路。新陈代谢(Caffeine metabolism)、细菌分泌系统(Bacterial secretion system)、植物与病原体相互作用(Plant-pathogen interaction)、胞间连丝(Gap junction)、群体感应(Quorum sensing)是显著富集的通路(Pathway),这表明显著富集的通路多与物质的生物合成、细胞的生物代谢、病害胁迫过程等相关。6.挑选与对照组(A)相比,抗病组(B)中表达量上调的Han-miR21的4个靶基因和表达量下调的Han-miR43的5个靶基因做进一步的定量检测。Han-miR21的1个靶基因下调、Han-miR43的3个靶基因上调,与Han-miR21的上调、Han-miR43的下调表达结果呈负相关,符合miRNA与其靶基因调控的规律。7.成功构建向日葵4个miRNA的表达载体:pBI121-Han-miR21、pBI121-Han-miR25、pBI 121-Han-miR43、pBI121-Han-miR45。