肝脏作为机体内最大的腺体,不仅参与了糖类、脂类、蛋白质等物质的代谢,还具有排泄、分泌、生物转化等重要功能。因此,当肝脏功能出现损伤时,不仅机体内的物质代谢会发生紊乱,其他重要器官的功能也会出现障碍。临床上的肝脏手术如肝脏移植、肝部分切除术等的实施过程中均需要暂时性阻断肝脏的血液供应,但当其血液供应被重新恢复时即会发生肝缺血再灌注损伤(hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI)。因此,HIRI已成为临床肝脏外科治疗过程中的主要并发症。它的发生也是引发肝脏手术患者出现手术失败、肝功能衰竭,以及术后愈后较差的主要原因。实验研究表明,肝脏被阻断的血供被重新恢复时即会有大量活性氧族(reactive oxygen species:ROS)的产生,高活性分子ROS对肝脏组织细胞引发的过氧化损害是导致HIRI发生的主要机制之一。ROS的成员主要包括超氧阴离子(O2-.),过氧化氢(H2O2)和羟自由基(OH.)等。ROS能与细胞内的重要蛋白质、酶、核酸、细胞骨架及脂质物质发生过氧化反应,导致线粒体功能障碍和胞膜结构受损,甚至组织和细胞的死亡。肺脏是机体内对氧气供应量和缺氧状态非常敏感的脏器。在缺血再灌注氧气供应量发生变化时,肺脏是否也会发生氧化应激反应,遭受过氧化损伤?超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases,SOD)是机体内重要的抗氧化酶之一,它能催化O2-氧化生成氧和H2O2。因此,SOD是清除O2-的重要酶蛋白,在机体内的抗过氧化过程具有重要作用。哺乳动物体内共有三中SOD亚型:在线粒体内以锰作为辅基的锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD),在细胞胞浆中以铜和锌作为辅基的铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)。细胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD,EC-SOD)是机体内唯一位于细胞外的SOD亚型,它依靠自身的肝素结合域(heparin-binding domain,HBD)能与细胞外基质和细胞表面结合。以往众多的抗氧化功能研究主要集中于Cu/Zn-SOD和Mn-SOD。但也有实验研究发现:细胞外的EC-SOD在机体内的抗氧化应激和抗炎反应中可能发挥了更重要的作用。HIRI可引起其他脏器的损伤,包括远隔脏器心、脑、肺等。这些远隔脏器的损伤与炎症、氧化应激、凋亡等密切相关。EC-SOD在肺脏组织内大量表达,在HIRI发生后,肺组织遭受损伤时,肺组织内的抗氧化酶EC-SOD基因和蛋白表达如何变化,在缺血再灌注后是否发挥了抗氧化应激作用,有待研究。本研究通过阻断大鼠肝左叶、肝中叶的血管和胆管蒂再重新恢复其灌注的方法制造大鼠HIRI模型,然后测定大鼠肺组织内的MDA和H2O2水平变化,以及EC-SOD的mRNA和蛋白表达改变。探讨HIRI发生后肺组织内的氧化应激状态以及EC-SOD在此过程中的抗氧化应激作用。目的:观察大鼠HIRI模型肺组织内的MDA水平、H2O2水平以及抗氧化酶EC-SOD的基因和蛋白表达水平变化,探讨HIRI发生后肺组织内的氧化应激状态以及EC-SOD在此过程中可能发挥的抗氧化作用。方法:1大鼠HIRI模型的制备及标本处理选用体重190-210g健康雄性Wistar大鼠12只,实验动物均购于河北医科大学实验动物。将大鼠随机分为HIRI组(6只),Conrol组(6只)。采用自配的6%水合氯醛(0.5ml/kg)对大鼠进行腹腔注射麻醉。按照Kohli等人的实验方法,用自制的手术玻璃针小心分离胆管和肝血管,分离出通往肝左叶和肝中叶的血管以及胆管蒂,并采用无损伤血管夹夹闭。夹闭30分钟后撤去血管夹,重新恢复肝中叶和肝左叶的血液灌注,制造70%的肝实质HIRI模型。Conrol组大鼠被麻醉后,只分离通往肝中叶和肝左叶的血管及胆管蒂,30分钟后关闭大鼠腹腔。恢复肝脏血液供应6小时后再次重新将其麻醉,首先收集大鼠血液,用于血清ALT(丙氨酸氨基转移酶)和MDA含量检测;取大鼠肝脏和肺脏,将肝脏置于4%多聚甲醛溶液中固定,采用HE染色法观察大鼠肝组织形态结构的改变;将大鼠肺脏置于液氮中,用于抗氧化酶EC-SOD的基因水平和蛋白水平检测,以及肺组织内MDA含量和H2O2含量检测。2测定指标及检测方法2.1 HE染色观察大鼠肝脏形态结构的改变肝组织经梯度乙醇脱水、二甲苯透明,石蜡包埋处理后,进行切片,切片厚度约5μm,采用苏木精伊红进行染色,Olympus光学显微镜观察大鼠肝脏组织形态结构的变化。2.2大鼠血清ALT活性检测收集的大鼠血液未进行抗凝处理,静置30分钟后,3000rpm离心10min,收集血清,采用全自动生化分析仪测定ALT活性。2.3大鼠血清MDA含量检测大鼠血清内MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒测定。2.4大鼠肺组织匀浆制备以及MDA含量检测从-80℃冰箱中取出HIRI组和Control组大鼠肺组织,按照10mg/100μl的处理比例,加入4℃匀浆缓冲液(PH7.4,磷酸钾缓冲液50mmol/L,PMSF1mmol/L,盐酸苯甲脒1mmol/L,Na Cl0.5mol/L,0.1%Tween-20,β-巯基乙醇5mmol/L,EDTANa31mmol/L),冰浴下进行匀浆处理,匀浆液于4℃,4000rpm离心20分钟,收集上清即制成10%肺组织匀浆,匀浆内MDA含量采用南京建成丙二醛(MDA)测定试剂盒进行检测。2.5大鼠肺组织H2O2含量检测将从-80℃冰箱中取出的肺组织按照10mg/100μl比例加入预冷的匀浆缓冲液(50mmol/L磷酸钾缓冲液,PH7.4,1mmol/L盐酸苯甲脒,1mmol/L PMSF,0.1%Tween-20,0.5mol/L Na Cl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巯基乙醇),冰浴下进行匀浆处理,匀浆液于4℃,4000rpm离心20分钟,收集上清即制成10%肺组织匀浆。肺组织匀浆内H2O2含量采用钼酸比色法进行检测,以每克样本蛋白所含H2O2量(mmol/g pro)表示肺组织H2O2含量。2.6大鼠肺组织EC-SOD mRNA表达水平检测采用TRIzol试剂提取大鼠肺组织总RNA,并反转录生成c DNA。GAPDH作为内参照,RT-PCR法测定EC-SOD mRNA表达水平。EC-SOD扩增产物的灰度值与内参照GAPDH扩增产物灰度值之比,表示目的基因EC-SOD的相对表达水平。2.7大鼠肺组织EC-SOD蛋白表达水平检测采用免疫印迹法测定大鼠肺组织EC-SOD的蛋白表达水平。将-80度冷冻的大鼠肺组织制成匀浆液,离心后取上清,并做蛋白变性处理。蛋白总量采用改良Lorry法进行测定。电泳蛋白上样量为62ug。经过电泳、转膜及封闭处理后,在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD一抗,室温静置过夜。经过洗膜处理后,加入抗兔IgG二抗(辣根过氧化物酶标记)。按发光试剂操作指导先后进行显影、定影、晾干处理。扫描胶片并进行图像分析,EC-SOD灰度值与内参照GAPDH灰度值之比表示目的蛋白的相对表达水平。结果:1大鼠肝脏组织HE染色形态学观察奥林巴斯光学显微镜下,对照组大鼠肝组织切片显示:肝细胞排列整齐形成条索状,围绕在中央静脉周围成放射状排列,肝血窦大小均匀未见扩张充血。肝缺血再灌注损伤组大鼠肝组织切片显示:肝细胞有受压萎缩现象,并且淤血严重,肝血窦扩张充血比较明显,肝细胞的胞浆内有空泡出现,HE染色变浅,可见部分肝细胞水肿,体积有所增大。2大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶活性改变对照组大鼠血清中丙氨酸氨基转移酶为20.03±5.23U/L,而肝缺血再灌注损伤组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶为87.43±9.06 U/L。肝缺血再灌注损伤组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶水平明显高于对照组(P<0.01)。3大鼠血清中丙二醛含量变化对照组大鼠血清中丙二醛的含量为12.69±2.29 umol/L,肝缺血再灌注损伤组大鼠血清中丙二醛的含量为17.54±1.96 umol/L。肝缺血再灌注损伤组大鼠血清丙二醛含量明显高于对照组(P<0.01)。4大鼠肺匀浆内丙二醛含量变化HIRI组大鼠肺内丙二醛含量(14.09±2.47 mmol/g)明显高于对照组大鼠肺内丙二醛含量(9.81±1.89mmol/g,P<0.01)5肺匀浆内H2O2含量变化HIRI组大鼠肺内H2O2含量(19.52±3.03 mmol/g)明显高于Con组大鼠肺内H2O2含量(13.39±1.97mmol/g)(P<0.01)。6肺组织内EC-SOD mRNA表达量的变化以GAPDH作为内对照,采用RT-PCR的方法测定大鼠肺组织内抗氧化酶EC-SOD mRNA表达量的改变。HIRI组大鼠肺组织内的EC-SOD mRNA水平(0.91±0.13)明显高于Con组(0.49±0.08)(P<0.01)。此结果说明HIRI组大鼠肺组织内EC-SOD表达明显升高。7大鼠肺组织内EC-SOD的蛋白表达水平大鼠肺组织内细胞外-超氧化物歧化酶(EC-SOD)的蛋白相对表达量,采用Western blotting方法测定。将其内参照GAPDH的比值作为其相对表达量,然后进行结果统计。数据表明:对照组大鼠肺组织中EC-SOD的蛋白相对表达量(0.71±0.12)明显低于肝缺血再灌注损伤组的相对表达量(1.09±0.18)(P<0.01),也表明大鼠肺组织内EC-SOD表达明显增强。结论:1大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型肺组织中MDA和H2O2含量均明显增加。提示:在肝脏发生缺血再灌注损伤时,肺组织也遭受了过氧化损伤。2肺组织内EC-SOD的mRNA和蛋白表达水平在肝脏缺血再灌注诱发肺组织遭受过氧化损伤时明显增强。提示:抗氧化酶EC-SOD在此过程中可能参与了抗氧化应激反应