失血性休克若治疗不当或不及时,可作为第一次打击使机体处于不同程度的全身炎症反应综合征(SIRS),其后感染造成第二次打击,放大已存在的炎症状态而发生过度的SIRS,甚至多器官功能障碍综合征(MODS)。急性肾损伤(AKI)是休克、感染、创伤等诱导MODS发生过程中常见的病理过程之一,其发生对MODS的发展及预后具有重要作用。失血性休克使肾血流量明显减少,尤其肾皮质血流减少更显著,而80％的功能性肾小球位于肾皮质,这样就造成了明显的肾小球滤过率下降及肾功能损伤。肾缺血后,在磷脂酶的作用下,细胞膜的双层脂质遭到破坏降解,导致肾小管通透性的增加,肿胀的肾小管上皮细胞阻塞肾小管,从而阻碍了血流的通过,导致肾小球滤过作用的下降。随着缺血被纠正,即再灌注后大量的酸性物质、以及由于肠屏障功能损伤导致肠源性内毒素血症和肠道细菌移位进入血液。肾缺血缺氧后引起细胞内Ca2+的增加,形成Ca2+超载。胞浆中Ca2+过多,可激活黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,从而产生大量氧自由基,使细胞膜及其结构遭到又一次的损伤,进而导致肾功能障碍,炎性介质释放如IL-1、IL-6、IL-8、ICAM—1、TNF-α诱导炎性瀑布,放大炎性反应,进一步产生加重肾损伤。　　 传统抗胆碱能药物具有解痉、改善微循环、抑制钙超载和生物膜的脂质过氧化,抑制炎症介质的产生和释放,对组织细胞起保护作用。自20世纪60年代起被广泛用于临床,但因需剂量过大、不良反应较多,限制了其临床应用。新型强效抗胆碱能药盐酸戊乙奎醚(Penehyclidine hydrochloride,PHC),与传统抗胆碱能药相比,具有选择性M1、M3和N1、N2受体拮抗作用,对中枢和外周均有很强的抗胆碱作用,而对M2受体无明显作用,对心血管系统干扰小。研究发现盐酸戊乙奎醚对各种原因导致的急性肺损伤具有保护作用:用于心脏瓣膜置换术可明显减轻心肌缺血再灌注后脂质过氧化和过度的炎性反应,减轻心肌受损的程度；对缺血再灌注损伤的心、脑、肾等器官均具有保护作用。可见,PHC有较好的器官保护作用,目前,PHC主要用于有机磷农药中毒的抢救、麻醉前用药以及感染性休克的救治等方面。　　 近年来Moore首次提出了二次打击的概念,认为创伤、休克等作为第一次打击,引起全身炎症反应,随后一个较小的刺激放大了已存在的炎症状态而引起器官组织损害,甚至发生MODS。刘健等研究发现,山莨菪碱对兔失血性休克合并内毒素血症二次打击所致器官损伤具有一定的保护作用,但山莨菪碱作用短暂,且不具有选择性抗胆碱能作用。我们前期研究表明,PHC对“失血性休克一内毒素”二次打击大鼠肺损伤有保护作用。本研究,通过观察不同剂量PHC对“失血性休克-内毒素”二次打击wistar大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-8(IL-8)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、肾组织粘附分子(ICAM-1)、核转录因子-κB(NF-κB)的影响以及肾组织病理学改变,旨在进一步观察PHC对二次打击大鼠的肾保护作用。　　 材料与方法:　　 1.实验动物　　 健康wistar大鼠45只,雄性,体质重180-230g,6-7周龄,由南方医科大学动物实验中心提供(许可证号:SCXK粤2006-0015)。　　 2.动物分组　　 Wistar大鼠45只,随机分为五组,每组9只:　　 ①假二次打击组(S组)②二次打击组(M):失血性休克+内毒素(LPS)2 mg/kg+0.9％氯化钠注射液③PHC1 mg/kg组(PHC1组):失血性休克+LPS(2 mg/kg)+PHC(1 mg/kg)④PHC2 mg/kg组(PHC2组):失血性休克+LPS(2 mg/kg)+PHC(2 mg/kg)⑤PHC3 mg/kg组(PHC3组):失血性休克+LPS(2 mg/kg)+PHC(3 mg/kg)　　 3.二次打击模型的建立参照FAN[1]等的方法建立二次打击模型,分首次打击(失血性休克+复苏再灌注)和二次打击(内毒素血症)两个阶段。大鼠实验前晚禁食,自由饮水,次日上午称重,20％乌拉坦(5 ml/kg)腹腔注射麻醉,仰卧位固定于鼠板上,利用保温灯使大鼠体温控制于(37+1)℃,无菌操作下行左侧股动脉及股静脉插管术并用肝素生理盐水冲洗导管,股动脉插管接压力传感器监测血压,血压稳定15min后,开放股动脉导管缓慢匀速放血(血液肝素化保存以供回输),并在15 min内使平均动脉压(MAP)降至35+5 mmHg(放血量约占全血量的30％)形成失血性休克,通过间断放血和股静脉导管回输血液维持1h,然后进行液体复苏,时间为90 min。先输入保存的血液,然后输入1.5倍于血量的乳酸林格液,血压恢复到放血前的97％或以上为复苏成功。成功30 min后,经股静脉注射LPS2mg/kg(Escherichia coli0111:B4美国Sigma公司)。60 min后,M组经股静脉注射生理盐水1 ml,PHC1组、PHC2组、PHC3组分别经股静脉注射PHC1、2、3 mg/kg,均稀释为1ml,S组只行股动脉、股静脉插管不放血。2 h后,股动脉采血2 ml,离心取血清于-80℃冻存待检血清TNF-α、IL-1、IL-8、Cr、BUN含量,放血处死大鼠取肾脏组织放于10％福尔马林液中固定,免疫组织化学的方法测定肾粘附分子(ICAM-1)和核因子-κ3(NF-κB)的表达,HE染色观察肾的病理改变。　　 4.指标测定　　 (1)Liquidchip法测定血清TNF-α、IL-1、IL-8含量放血处死大鼠时取动脉血液2 ml,静止30 min后,3000 r/min,4℃,离心15 min,离心后取血清,操作严格按照试剂盒使用说明书进行,使用Lum inex100液相芯片机血清TNF-α、IL-1、IL-8含量,血清cr、BUN测定使用南方医院检验科自动生化分析仪(Olympus Au5400)。　　 (2)肾组织病理学观察肾组织经10％甲醛固定,自动脱水,浸蜡,包埋,切片,常规HE染色。Nikon Eclip Se Ti-S显微镜200倍镜下观察。　　 (3)测定肾组织ICAM-1和核因子-κB采用免疫组织化学方法进行检测,显微镜下观察组织中ICAM-1和核因子-κB的表达。依照细胞阳性着色程度(抗原含量)分为:弱阳性(+)-1分；中等阳性(++)-2分；强阳性(+++)-3分。依照阳性细胞数量分为:弱阳性(+,指阳性细胞总数在25％以下)；中等阳性(++,指阳性细胞总数在25％～49％)；强阳性(+++,指阳性细胞总数在50％以上)。采用积分综合计量,计算公式:(+)％×1+(++)％x2+(+++)％×3,总数值<0.5者为(+)；0.5-1.0者为(++)；1.0-1.5者为(+++)；>1.5者为(++++),至少随机观察5-10个HPF。　　 5.采用SPSS13.0软件统计处理,计量资料用均数±标准差((x)±s)表示,采用完全随机设计资料方差分析,首先进行方差齐性检验,方差齐采用One-Way-ANOVA方法检验,方差不齐者采用welch检验,组间比较有显著性差异,多重比较若方差齐采用LSD检验,若方差不齐采用Dunnett T3检验。等级资料采用Kruskal-Wallis H检验。以α=0.05为检验水准。　　 结果：　　 1.血清TNF-α、IL—1、IL-8、Cr、BUN的变化与S组比较,M组与PHC1、PHC2、PHC3各治疗组血清TNF-α、IL-1、IL-8、Cr、BUN含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)；与M组比较,PHC1、PHC2、PHC3各治疗组血清TNF-α、IL-1、IL-8、Cr、BUN含量降低,差异有统计学意义(P<0.05):与PHCl比较,PHC2与PHC3组血清TNF-α、IL-1、IL-8、Cr、BUN含量较高,差异有统计学意义(P<0.05):PHC2与PHC3组血清TNF-α、IL-1、IL-8差异无统计学意义(P>0.05),血清Cr、BUN含量降低(P<0.05)。　　 2.肾组织ICAM-1和NF-κB的表达M组ICAM—1主要在肾小球毛细血管、系膜区及间质大量表达,肾小管中亦有表达,表现为不均匀的棕黄色颗粒状物；PHC1、PHC2、PHC3组ICAM-1在肾小球毛细血管、系膜区及间质少量表达,表现为不均匀的淡黄色颗粒状物；S组基本无阳性表达。各组间ICAM-1的表达有统计学差异(P<0.001)。　　 NF—κB主要在肾小管上皮细胞表达,表现为不均匀的黄褐色颗粒状物,M组表达显著；PHC1、PHC2、PHC3组在肾小管上皮细胞可见少量棕黄色颗粒状物；S组基本无表达,各组间NF-κB的表达有统计学差异(P<0.001)。　　 3.肾组织病理学的改变M组肾小管上皮细胞肿胀,核浓缩空泡变性、坏死,管腔内可见大量的细胞管形、蛋白管形及脱落的细胞,间质血管扩张、充血、内有大量炎性细胞浸润。PHC1、PHC2、PHC3组。肾小管上皮细胞肿胀明显减轻,间质少许充血及炎细胞浸润,S组肾组织结构基本正常。　　 结论：　　 1.PHC可降低“失血性休克-内毒素”二次打击大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-8水平,降低Cr、BUN含量,抑制ICAM-1、NF-κB表达。不同剂量PHC治疗组肾组织病理学改变比M组明显减轻,因此,PHC具有肾保护作用。　　 2.与PHC2 mg/kg组、3 mg/kg组相比,1 mg/kg组血清TNF-α、IL—1、IL-8、Cr、BUN明显降低,肾组织NF-κB和ICAM-1表达减少,肾病理改变轻、肾保护作用相对更好。