正如《自然》杂志所定义的,合成生物学的最终目标是构建有用功能的新型生物系统。为了实现这一目标,我们需要构建新的生物学元件,生物学逻辑门通路和生物学系统。为了成功构建功能型的新型生物系统,生物元件的选择显得尤为重要。CRISPR,规律成簇的间隔短回文重复序列,是细菌和古细菌在长期演化中形成的一种适应性免疫系统,可用来对抗入侵病毒和外界DNA,它具备优秀的可编程性,是合成生物学领域新兴的遗传基因线路构建工具。根据Cas蛋白的不同,可将CRISPR系统分为I型、II型、III型,目前被广泛应用的系统为II型,包括Cas9、Cpf1、C2c2（Cas13a）。在本论文中,主要利用两种CRISPR-Cas II型系统的突变系统去构建遗传基因线路:CRISPR-d Cas9与CRISPR-d Cpf1。这两种突变型系统是将Cas9蛋白与Cpf1蛋白的功能结构域进行突变,使其失去核糖内切酶的功能,但保留它们靶向目的基因的能力,d Cpf1还保留了其加工pre-cr RNA的功能。据已发表的文献描述,当d Cas9蛋白结合到特定DNA元件上,例如,当d Cas9蛋白结合到启动子上游会促进下游蛋白产物的表达,而当d Cas9蛋白结合到核心启动子区域则会抑制转录起始,从而抑制下游蛋白表达。因此,d Cas9可被视为基因调控元件,与d Cas9类似,d Cpf1也具有同样的基因调控功能。此外,这两种系统具有良好的可编程性,只需要改变d Cas9的g RNAs或d Cpf1的cr RNAs,便可靶向多个不同的DNA序列。本论文充分利用d Cas9与d Cpf1系统的特性,在真核酵母细胞中构建多元遗传基因线路。在本论文中,使用绿色荧光蛋白作为基因线路的报告基因（线路输出信号）,利用吉普森（Gibson）组装和金门（Golden Gate）组装来构建宿主线路转录单位所必需的质粒。为了构建基于CRIPSR-d Cas9的基因通路,将分别表达g RNA、d Cas9、anti-CRISPRs和GFP的质粒整合到酵母基因组中,为了节约时间成本,所有的质粒载体均为穿梭质粒,该种质粒既可以在大肠杆菌中进行自主复制,也可以转化杂交到酵母的基因组中。先利用大肠杆菌构建出表达质粒,再转化到酵母基因组中。最后,使用半乳糖、β-雌二醇诱导含有遗传基因线路的酵母,利用流式细胞仪检测和收集酵母细胞的荧光信号数据,再使用软件R.studio分析荧光值,统计分析基因线路在酵母中的工作情况。同样的策略亦适用于基于CRISPR-d Cpf1的基因通路,将分别含有d Cpf1,pre-cr RNA和y EGFP的质粒先后转化杂交到酵母的基因组中,在酵母中完成基因通路的构建后,用Mg²⁺和2%半乳糖进行诱导,利用流式细胞仪收集数据,最后统计分析该通路的工作情况。该论文成功构建基于CRISPR-d Cas9和CRISPR-d Cpf1的遗传逻辑门。基于CRISPR-d Cas9系统成功组建八个非门,十个缓冲门以及两个β-雌二醇生物传感器,生物传感器可以检测出环境中少量的β-雌二醇（8 nmol/L）。第一,基于d Cas9构建的非门能够在2%的半乳糖诱导下表现良好,非门的关/开效率可达到0.3;第二,缓冲门的构建引入了四种anti-CRISPR（Lm Acr IIA2、Lm Acr IIA4、yopt_Lm Acr IIA4、yopt_St Acr IIA5）,且每种anti-CRISPR产生的效果都不一样,总体来说,所有的anti-CRISPR均能够让荧光强度回升,其中Lm Acr IIA4回升的最显著;第三,成功构建β-雌二醇生物传感器,该生物传感器可以在30℃,含有2%葡萄糖的SDC培养基中稳定检测β-雌二醇含量。基于CRISPR-d Cpf1（d Fn Cpf1、d Lb Cpf1）系统成功构建出八个非门,并尝试利用Mg²⁺和2%的半乳糖作为通路的调控开关。其中,利用Mg²⁺对d Cpf1非门基因通路进行诱导,对基因通路的效率仅有轻微的改变,且这种改变无线性关系,因此,在酵母细胞中Mg²⁺对d Cpf1蛋白调节基因通路的功能并不明显。而用2%半乳糖对d Cpf1构建的遗传基因通路进行诱导,成功将荧光信号强度降低33%,虽然荧光强度降低百分比较低,但是通路开关工作正常。本论文利用d Cas9（Spyd Cas9）、d Cpf1（d Fn Cpf1d Lb Cpf1）、anti-CRISPR（Lm Acr IIA2、Lm Acr IIA4、yopt_Lm Acr IIA4、yopt_Lm Acr IIA5）此三种生物学元件成功在酵母细胞中构建遗传基因通路,证实了CRISPR-d Cas9、CRISPR-d Cpf1、anti-CRISPR系统在构建合成生物学中的重要应用。通过将d Cas9与多种不同的调控因子结合,可以实现基因组范围内的定向抑制基因表达,激活基因表达,在同一细胞内的双向调控和较大DNA区域上表观遗传学修饰的改变。将d Cas9与Mxi1结构域结合,可以减少基因线路的泄露,将anti-CRISPR与荷尔蒙结合结构域融合,赋予anti-CRISPR检测β-雌二醇的功能,将能抑制d Cas9的anti-CRISPR组合到同一基因线路中,是合成生物学中一个新颖的应用,也扩充了合成生物学生物元件数据库。除此之外,基于d Cas9基因工程表达调控元件还可以方便地进行多位点的调控。因为只要多个不同的g RNA的存在,同一个d Cas9即可靶向不同基因。CRISPR-Cpf1是一种最简单的CRISPR免疫系统,不仅可以切割DNA,也切割RNA。与CRISPR-Cas9不同的是,Cpf1能够独自地对cr RNA前体pre-cr RNA进行加工,然后利用加工后产生的cr RNA特异性地靶向和切割DNA,因此不需要来自宿主细胞的核糖核酸酶和tracr RNA。本论文中使用的d Cpf1失去了的核糖核酸酶的活性,但仍保留了加工pre-cr RNA的功能。将d Cpf1引入合成生物学研究领域,作为基因工程表达调控元件,d Cpf1可以更精准的靶向目的基因,也具有更强大的调控功能,将它与不同的功能域相融合,可以执行更多的功能,具有更少氨基酸分子量的d Cpf1将能替代d Cas9执行更多的合成生物学功能。本论文中基于d Cpf1构建的遗传基因通路的抑制作用低的原因可能是未设计合适的pre-cr RNA,也可能是没有将d Cpf1与恰当的功能域相融合,在未来的研究工作中,将会着重研究增强d Cpf1调控能力的方法。本论文成功证明了CRISPR-d Cas9和CRISPR-d Cpf1系统在酵母合成生物学中的重要应用。β-雌二醇生物传感器的成功构建体现了合成生物学在工业和生物医疗研究中实用价值,也为合成生物学走向应用研究提供了参考价值。