论文部分内容阅读
外周淋巴组织趋化性细胞因子(SLC)具有趋化T细胞和成熟树突状细胞及B淋巴细胞的能力,并可引发T细胞归巢,具有确定的依赖T细胞的抗肿瘤作用.癌胚抗原CEA(carcinoembryonic antigen)是一种广谱肿瘤标志物,在恶性肿瘤的鉴别诊断,病情监测等方面有着重要的临床价值,是肿瘤治疗理想的靶抗原,抗CEA抗体作为导向药物载体,携带具有细胞杀伤活性的同位素、化疗制剂、毒素、药物前体,进行肿瘤导向治疗有着广泛的应用前景.细胞因子-抗体融合蛋白可以在体内有效的将细胞因子定位到表达肿瘤相关抗原的肿瘤细胞处,在肿瘤的治疗中已成为一种有效的靶向性策略,此融合蛋白将肿瘤抗体分子的特异性与细胞因子的多能性很好的保留了下来.该实验室利用基因工程技术将编码SLC和抗CEA单链抗体的核苷酸序列克隆至经改变多克隆位点序列而适合表达双特异抗体的载体pALM中,成功构建了双功能抗体融合蛋白分子.该研究在此基础上,在重组表达载体pALMSLC-anti CEA ScFv上,PCR扩增出双功能分子SLC-anti CEA ScFv的编码序列,经酶切处理后,分别克隆至同样经酶切处理的载体pTMF和pTFRSM中,PCR和测序鉴定结果表明,成功构建了重组表达载体pTMF SLC-anti CEA ScFv和pTFRSM SLC-anti CEA ScFv.SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明目的蛋白SLC-anti CEA ScFv在各载体中均获得特异表达,分别从不同的诱导表达时间、温度等方面摸索了SLC-anti CEAScFv在不同载体中的表达条件,结果显示,该融合蛋白SLC-anti CEA ScFv在P中的表达量最高,主要以包涵体的形式存在,而在载体P中的表达产物主要以可溶形式存在,证明了分子伴侣FkpA可以显著提高目的蛋白的可溶性表达.表达产物采用镍离子螯合层析法进行了纯化,纯化率达到了95%.在获得了纯化的SLC-anti CEA ScFv的样品后,首先采用ELISA法对其抗原结合活性进行了测定,以OD490比阴性对照高出2.5倍为活性合格的标准.结果显示,SLC-anti CEA ScFv与T细胞Jurkat细胞和结肠癌细胞SW116均有较高的结合活性.说明它具有较好的靶向性和特异性.在此基础上,对活性合格样品进行了趋化活性的研究,结果也比较理想,在以外周血淋巴细胞为计数细胞时,该融合蛋白表现出明显的趋化作用,其浓度为0.225 ug/ml-1.65ug/ml时对淋巴细胞的趋化指数最高.趋化实验和ELISA实验结果显示我们获得了有生物活性的双功能抗体融合蛋白SLC-anti CEA ScFv,并证明了其具有潜在的抗肿瘤活性.