构建双荧光可视化TGF-β诱导的EMT的细胞模型

来源 :浙江大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:chenrongxu222
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上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是上皮细胞转化为具有间质表型细胞的生物学过程,表现为上皮细胞失去自身的特点,并获得间充质特性。EMT在胚胎发育、组织重建、慢性炎症、细胞获得干性、多种纤维化疾病和癌症转移中都发挥了重要作用。其中,转化生长因子β(transforming growthfactorβ,TGF-β)是诱导EMT的重要因子。  由于EMT在正常生理活动以及疾病发生发展过程中的重要作用,快速的筛选EMT相关分子药物具有显著地意义和应用价值。本文介绍了我们利用EMT相关标志物,通过构建E-cadherin和Vimentin启动子报告荧光质粒从而成功建立了快速指示EMT的可视化工具。已知E-cadherin的消失和Vimentin的上调是EMT的最为突出的变化,我们构建了E-cadherin启动子(-1000-+125bp)驱动的GFP报告质粒(E-cad-GFP)和Vimentin启动子(-1027-+1121bp)驱动的RFP报告质粒(Vim-RFP)。我们将这两种荧光质粒分别转染人乳腺上皮细胞MCF10A,之后我们分别挑取了两个稳定表达E-cad-GFP的单克隆M6和13G以及两个稳定表达Vim-RFP的单克隆ZB1和ZB101,这四个单克隆都良好的响应TGF-β刺激介导的EMT过程并发生相应的荧光改变。此后我们将这四株细胞两两组合,从中我们得到最好的两个混合细胞M6+ZB1和13G+ZB101。在细胞处于正常上皮形态时E-cadherin介导的绿色荧光明显显示,而vimentin介导的红色荧光并不明显,但当细胞在受到TGF-β刺激48小时后,细胞发生了明显的EMT变化,此时细胞中的绿色荧光明显降低,相反的红色荧光明显增强。根据以上结果我们认为这两种荧光的表达可随这两种EMT标志物的启动子的变化灵敏改变。在随后的试验中我们更证实了这两株混合细胞可以响应除TGF-β刺激外其他细胞因子TNF-α、VEGF、EGF、PDGF-BB的刺激,由此我们认定该细胞模型可以用来快速方便的检测EMT过程。  我们的实验证明我们建立的两株混合细胞模型均可以正确反映EMT的发生发展,可以用于大规模快速筛选与EMT相关的基因、小分子药物以及大分子调节因子等。该细胞模型为EMT的研究提供了快速,可视化的工具,对药物筛选及分子机制的研究创造了有较好的应用前景。
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