本研究分为以下三部分： 第一部分： 目的：探讨口腔黏膜细胞的培养方法，为进一步以口腔黏膜细胞为种子细胞构建组织工程化尿道提供实验依据。 方法：体外分离兔口腔黏膜细胞，取部分细胞与经丝裂霉素灭活的3T3(i3T3)成纤维细胞进行共培养，定期观察细胞形态变化及生长增殖情况。以非共培养的口腔黏膜细胞作为对照组。同时，对体外培养获得的口腔黏膜细胞进行广谱角蛋白抗体(AE1/AE3)和K19免疫荧光染色鉴定；流式细胞仪检测第2代共培养细胞的AE1/AE3阳性细胞百分比，细胞计数及MTT测定以判断细胞增殖能力。 结果：与灭活的3T3成纤维细胞共培养的口腔黏膜细胞形态均一，有较强的增殖能力，可传代至7～8代。非共培养的口腔黏膜细胞则形态多样，传至第2代时，即开始出现老化，细胞贴壁及增殖能力均明显减弱。免疫荧光染色显示，体外培养获得的口腔黏膜细胞AE1/AE3免疫荧光染色阳性，40％细胞K19染色阳性。流式细胞仪检测结果表明，第2代共培养的口腔黏膜细胞AE1/AE3阳性细胞百分比＞95％。接种于i3T3细胞上的口腔黏膜细胞传至第3代时可获得细胞数量在20×106以上，完全可满足组织工程对细胞数量的要求。 结论：口腔黏膜细胞在有灭活的3T3成纤维细胞存在时可成功培养和扩增，为进一步将其作为种子细胞构建组织工程化尿道奠定了良好的基础。 第二部分： 目的：探讨以兔口腔黏膜细胞为种子细胞与同种异体膀胱黏膜下脱细胞基质(bladderacellularmatrixgraft，BAMG)复合，构建组织工程化黏膜的方法。 方法：取雄性新西兰大耳白兔(体重0.3～0.5kg)口腔黏膜组织，分离获得口腔黏膜细胞，在有灭活的3T3细胞的培养皿上进行培养扩增，于接种后第二天开始每天定点倒置相差显微镜下观察细胞形态变化，绘制细胞生长曲线观察生长增殖情况，并行免疫荧光组织化学染色鉴定。取同种异体兔膀胱，经脱细胞处理制成BAMG，随机取小块组织行HE染色，观察脱细胞效果，将培养获得的第二代口腔黏膜细胞种植于BAMG上，通过HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BAMG的复合状况。 结果：倒置显微镜下观察发现，在有3T3细胞存在时，口腔黏膜细胞可传代至7～8代，其细胞形态均一，功能良好；细胞生长曲线显示口腔黏膜细胞于第8天开始呈对数增长，至第14天达到峰值。培养的口腔黏膜细胞行免疫荧光染色，显示出绿色荧光。BAMG经脱细胞处理后，随机取材行HE染色观察，未见有细胞存在，脱细胞效果良好。将采用3T3滋养层培养获得的口腔黏膜细胞，种植在BAMG上，通过HE染色，扫描电镜观察发现两者复合良好。 结论：兔口腔黏膜细胞可在体外成功培养、扩增，与同种异体BAMG复合后生长良好，为进一步利用此复合物构建组织工程化尿道奠定了基础。 第三部分： 目的：探讨以兔口腔黏膜细胞为种子细胞与同种异体膀胱黏膜下脱细胞基质(bladderacellularmatrixgraft，BAMG)复合，构建组织工程化尿道的可行性.。 方法：取雄性新西兰大耳白兔(体重0.3～0.5kg)口腔黏膜组织，分离获得口腔黏膜细胞。将口腔黏膜细胞与经丝裂霉素灭活的3T3(i3T3)成纤维细胞进行共培养。取同种异体兔膀胱，经脱细胞处理制成BAMG，随机取小块组织行HE染色，观察脱细胞效果，然后将与i3T3细胞共培养获得的第二代口腔黏膜细胞种植于BAMG上，通过HE染色及扫描电镜观察口腔黏膜细胞与BANG的复合状况。24只雄性兔随机分为实验组和对照组2组，距尿道外口2.0cm剥离实验兔尿道黏膜(2.0cm×0.8cm)。切取实验组兔口腔黏膜组织(1.0cm×0.4cm)，分离出口腔黏膜细胞，在有灭活的3T3细胞的培养皿上进行培养扩增，将培养获得的第二代口腔黏膜细胞种植于BAMG(2.2cm×1.0cm)上，植入实验组兔尿道缺损区域；对照组单纯采用无细胞植入的BAMG修复尿道。分别于术后1、2、6个月，观察排尿情况，行尿道造影，确定有无狭窄；随后处死实验兔，取修复段尿道黏膜行组织学检查和免疫组化检查。 结果：采用3T3滋养层细胞培养获得的口腔黏膜细胞形态均一，功能良好；BAMG经脱细胞处理后，随机取材行HE染色观察，未见有细胞存在，脱细胞效果良好。通过形态学，扫描电镜观察发现口腔黏膜细胞与BAMG两者复合良好。实验组兔均未发生与手术相关性死亡，于术后1、2、6个月，伤口愈合正常，排尿通畅，无尿瘘发生，修复段尿道大体形态，组织学检查和尿道造影显示带细胞修复的尿道形态完整，清晰宽敞，无狭窄发生；术后6个月，口腔黏膜细胞的鳞状上皮结构清晰可见，与尿道的移行上皮界限明显，行P63抗体染色，修复段尿道基底层细胞染色阳性。对照组12只兔中有两只在术后近1个月时因感染死亡，另有两只于术后1月时发生尿瘘，其余8只均发生不同程度的排尿困难，尿线变细或呈滴沥状，术后1、2、6个月，尿道造影显示修复段尿道有狭窄发生；大体形态显示尿道瘢痕性狭窄，黏膜苍白僵硬；组织学检查显示修复段尿道无明显移行上皮细胞形成，且2只兔黏膜及黏膜下发生严重的炎症反应。 结论：兔口腔黏膜细胞与同种异体BAMG复合后，可成功用于尿道缺损的修复，构建组织工程化尿道。