心肌肥厚是指心脏在长期负荷增加的情况下,心肌组织出现的增生性变化,表现为心肌细胞肥大,心肌纤维细胞增生,基质重构。虽然心肌肥厚在应激初期具有血流动力学方面的代偿意义,但持续性心肌肥厚可使心肌细胞损伤、纤维化,心脏收缩和舒张功能出现障碍,最终可导致心力衰竭甚至猝死。因此,深入研究心肌肥厚的发生发展机制,具有重要的临床意义。大量研究表明,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)对心肌肥厚形成和发展起重要作用。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)是RAAS的主要效应物质,它可以通过多种途径诱导心肌肥厚,活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)是其中的关键信号通路之一。容积敏感外向整流性氯通道(volume-sensitive outwardly rectifying chloride channel,VSOR Cl-)也称容积敏感性氯通道,在哺乳动物各组织细胞中广泛表达,参与了细胞增殖、迁移、分化、凋亡等多种生理病理过程,但顾名思义,其最主要的生理功能是调节细胞容积。当细胞容积增大时,VSOR Cl-通道开放,使水伴随着氯离子及其他渗透性物质排出细胞,维持细胞容积,此称之为调节性容积减少(regulatory volume decrease,RVD)。而心肌肥厚的最主要生理学基础是心肌肥大,即心肌细胞容积不可逆性增大,那么,在Ang II诱导心肌细胞肥大的过程中,是否有VSOR Cl-通道的参与?它发挥了何种作用?是通过什么机制?基于此科学假设,本研究在Ang II诱导心肌细胞肥大的模型上,观察VSOR Cl-通道的变化,并通过氯通道阻滞剂4,4’-二异硫氰基芪-2,2’-二磺酸(4,4-diisothiocya nostilbene-2,2’disulfonic acid,DIDS)及沉默VSOR Cl-通道的通道蛋白LRRC8A来阻断VSORCl-通道,检测其对Ang II诱导心肌细胞肥大的影响,并探讨其可能的机制。研究目的:1.构建Ang II诱导心肌细胞肥大模型。2.观察Ang II对VSOR Cl-电流及VSOR Cl-通道蛋白LRRC8A的表达的影响。3.探讨阻断VSOR Cl-通道对Ang II诱导心肌肥大的作用及可能的机制。研究方法:1.实验分组:分正常对照组、Ang II组、Ang II+si RNA组、Ang II+DIDS组、si RNA组、DIDS组,分别检测细胞面积、肥厚基因m RNA表达、ROS水平和NADPH氧化酶活性。2.H9C2心肌细胞培养及Ang II刺激构建心肌肥大模型。3.鬼笔环肽免疫荧光染色H9C2细胞显示细胞骨架检测细胞面积。4.实时定量PCR检测H9C2心肌肥大标志物ANP和β-MHC以及LRRC8A的m RNA的表达情况。5.Western-blot技术检测H9C2细胞中LRRC8A的蛋白表达水平。6.全细胞膜片钳技术检测H9C2心肌细胞VSOR Cl-电流变化。7.含有si RNA的腺病毒转染H9C2心肌细胞。8.荧光探针DCFH-DA染色检测H9C2心肌细胞内ROS水平。9.活性试剂盒检测NADPH氧化酶活性。研究结果:1.Ang II诱导H9C2心肌细胞肥大模型的构建:按Ang II经典刺激浓度10-6mol/L分别处理H9C2心肌细胞0h、12h、24h、36h、48h、72h。心肌细胞面积及肥大基因ANP、β-MHC的m RNA水平呈时间依赖性升高,其中心肌细胞面积在48h达到最大(P<0.05,n=100),肥大基因ANP、β-MHC的m RNA水平在36h达到最大(P<0.05,n=6),确定了检测上述各指标的最佳作用时间。2.Ang II对H9C2心肌细胞LRRC8A的影响:Ang II处理H9C2心肌细胞,能使LRRC8A的m RNA和蛋白表达水平呈浓度和时间依赖性升高。10-6mol/L Ang II分别作用36h和48h时,LRRC8A的m RNA和蛋白表达水平达到最大(P<0.05,n=6;n=3)。3.腺病毒RNAi干扰实验:含有si RNA的腺病毒转染H9C2心肌细胞72小时后,可有效下调LRRC8A的m RNA及蛋白表达水平,从4个候选序列中,筛选出沉默效果最好的片段供实验使用。4.Ang II对H9C2心肌细胞VSOR Cl-电流的影响:在等渗条件下,Ang II 20μmol/L作用10分钟能激活VSOR Cl-电流,而si RNA沉默LRRC8A可以显著抑制Ang II激活VSOR Cl-电流,峰电流下降81.60±5.88(P<0.05,n=4)。5.DIDS及si RNA沉默LRRC8A对Ang II诱导H9C2细胞肥大的影响:免疫荧光染色检测细胞面积结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌细胞面积明显增加(P<0.05,n=100),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=100);与Ang II组相比,Ang II+DIDS组和Ang II+si RNA组细胞面积明显减小(P<0.05,n=100);实时定量PCR结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌ANP和β-MHC m RNA表达量明显增加(P<0.05,n=6),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=6);与Ang II组相比,Ang II+DIDS组和Ang II+si RNA组心肌ANP和β-MHC m RNA表达量明显减小(P<0.05,n=6)。6.DIDS及si RNA沉默LRRC8A对Ang II诱导细胞ROS生成影响:荧光探针DCFH-DA检测结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌内ROS含量明显增加(P<0.05,n=5),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=5);与Ang II组相比,Ang II+DIDS组和Ang II+si RNA组心肌内ROS含量明显减小(P<0.05,n=5)。其中Ang II+si RNA组比Ang II+DIDS组ROS含量减少的更为显著(P<0.05,n=5)。7.DIDS及si RNA沉默LRRC8A对H9C2心肌细胞中NADPH氧化酶活性的影响,结果显示,与空白对照组相比,Ang II组心肌细胞NADPH氧化酶活性明显增加(P<0.05,n=5),DIDS组和si RNA组无差异(P﹥0.05,n=5);与Ang II组相比,Ang II+si RNA组心肌细胞氧化酶活性明显减小,而Ang II+DIDS组无差异(P<0.05,n=5)。研究结论:1.Ang II可显著地增加心肌细胞面积及肥大基因ANP、β-MHC的m RNA表达,成功构建了Ang II诱导心肌细胞肥大模型。2.Ang II处理H9C2心肌细胞可显著增加LRRC8A蛋白和m RNA表达量,并呈浓度和时间依赖性的正相关,同时Ang II也可激活VSORCl-电流,该电流可被沉默LRRC8A所阻断。3.应运DIDS及沉默LRRC8A阻断VSOR Cl-通道可以抑制Ang II诱导的心肌肥大。4.沉默LRRC8A可有效抑制NADPH氧化酶活性,减少ROS的生成,此可能为其抑制Ang II诱导细胞肥大的机制。