研究背景及目的:恶性肿瘤严重危害人类健康,具有对放、化疗不敏感,术后易复发等特点,其中结肠癌尤为突出。肿瘤药物中的周期特异性药物（cell cycle specific agents,CCSA）如依托泊苷（VP-16）仅对细胞增殖周期中的某一期有较强作用,但其作用强度受制于细胞周期中某一个或几个周期阶段的细胞数。此类药物对癌细胞作用一般较弱,需要一定时间才能发挥杀伤作用。提高此类药物抗癌作用的关键就在于通过某些因素影响肿瘤细胞周期的分布,促使S期和G2/M期百分比上调,从而增加CCSA类药物对肿瘤细胞的杀伤作用。目前,国内外从动物和细胞层面上均报道表明,刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）感染细胞后,可使宿主细胞发生G1期、S期向G2/M期的迁移,并将宿主细胞阻滞于G2/M期,从而利于创造适宜速殖子向缓殖子转化的生存环境。本文以小鼠结肠癌ct26细胞系为研究对象,观察刚地弓形虫RH株速殖子体外对ct26细胞周期分布的影响,探索弓形虫诱导细胞周期阻滞的机制,随后观察弓形虫体外感染对周期特异性抗癌药依托泊苷（VP-16）抗癌作用的影响;并进一步建立小鼠结肠癌ct26皮下移植瘤模型,探讨刚地弓形虫体内外诱导肿瘤细胞周期阻滞及相关抗癌作用的异同方法:1.分别建立感染复数（multiplicity of infection,moi）为2:1、4:1、8:1、16:1刚地弓形虫RH株速殖子体外感染小鼠结肠癌ct26细胞系模型,采用吉姆萨染色方法观察速殖子对细胞的侵入与寄生,采用流式细胞术检测ct26细胞在感染后6h、12h、24h、48h细胞周期分布变化。采用半定量逆转录PCR（RT-PCR）方法检测24h内G2/M期细胞周期相关蛋白cyclinB1和cdc2基因水平表达变化、western blot蛋白免疫印记方法检测cyclinB1蛋白水平表达变化。2.以常规体外培养的正常小鼠结肠癌ct26细胞为对照,给予不同浓度的依托伯苷（VP-16）药物干预,CCK-8细胞毒性检测方法观测经刚地弓形虫速殖子感染后的ct26细胞对VP-16药物敏感性的变化。3.在体外研究成果的基础上分别建立经弓形虫速殖子体外感染的ct26细胞和常规培养的小鼠ct26细胞小鼠皮下移植瘤模型,并作相应依托伯苷（VP-16）药物干预,观察经弓形虫感染后的ct26细胞接种小鼠皮下后成瘤时间、肿瘤生长大小、小鼠存活时间的变化,处死小鼠后剥离瘤块,计算依托伯苷抑瘤率的变化,制备小鼠肿瘤组织单细胞悬液经流式细胞术检测细胞周期分布改变。4.常规制备肿瘤组织石蜡切片,HE染色观察肿瘤组织形态学改变,免疫组织化学方法检测小鼠肿瘤组织微血管密度和VEGF、TSP1蛋白表达变化。分离提取荷瘤小鼠脾淋巴细胞,流式细胞术检测脾内T细胞亚群数量变化。结果:1.吉氏染色结合油镜下观察发现弓形虫RH株速殖子可在小鼠结肠癌ct26细胞内寄生。流式细胞仪检测发现弓形虫可在各作用时间明显改变ct26细胞周期分布,使G0/G1期细胞百分比下降,G2/M期百分比显著升高（P<0.01）,24h达到作用高峰,48h则细胞G2/M期百分比下降;其中moi为8:1的感染模型G2/M期阻滞最为明显,G₂/M期百分比在24h升高12.77%,而moi为2:1的感染模型24h可使S期和G₂期细胞百分比共同增长14.92%,可作为协同依托伯苷抗癌的有效模型。弓形虫感染ct26细胞3-24h,细胞cdc2转录水平在各个时间点未见明显变化,细胞cyclinB1从转录水平和蛋白水平均呈现为感染3h时表达增强,随后各时间点均明显降低的现象,cyclinB1基因转录水平在感染后24h只达到对照组的16.55%。2.CCK-8比色法检测结果显示以moi为2:1的弓形虫预先感染ct26细胞24h可有效增强各浓度VP-16对ct26细胞的杀伤作用,使细胞增殖抑制率上升约10%-15%（P<0.01）。3.以moi为2:1的弓形虫体外感染ct26细胞24h后再接种小鼠右腋皮下,成瘤时间较正常ct26细胞接种后晚3天左右,肿瘤生长缓慢,抑瘤率达42.57%,且可有效增强VP-16的抑瘤率。刚地弓形虫还能显著延长小鼠存活时间,染虫细胞对照组荷瘤小鼠平均存活天数达29.6±7.02天,与正常细胞对照组荷瘤小鼠平均存活天数（18.8±2.39天）相比有显著性差异,而VP-16给药无法显著延长小鼠存活时间;肿瘤组织单细胞悬液流式细胞仪检测显示细胞周期百分比呈现G₀/G₁期细胞百分比下降,S期细胞百分比上升的变化趋势,且出现凋亡率为20.58%的亚二倍凋亡峰,与体外试验结果不同。4.小鼠皮下移植瘤组织经常规HE染色发现经弓形虫感染后的细胞接种成瘤的组织较正常ct26细胞成瘤组织细胞排列紊乱,呈现点片状坏死,凋亡的特征;免疫组织化学检测显示弓形虫感染的小鼠肿瘤组织中MVD及VEGF表达水平低于对照组（P<0.05）,TSP1表达高于对照组（P<0.05）。流式细胞仪检测显示弓形虫感染组荷瘤小鼠脾组织CD4⁺T细胞百分比从正常ct26荷瘤小鼠的26.00%上升到46.96%（P<0.05）,CD4⁺/CD8⁺比例上调,CD8⁺细胞百分比无明显变化,。结论:1.刚地弓形虫速殖子可感染小鼠结肠癌ct26细胞系并诱导细胞发生G2/M期阻滞,且细胞周期蛋白cyclinB1表达缺失在G2/M期阻滞中起主要作用。2.刚地弓形虫速殖子对小鼠结肠癌ct26的细胞周期阻滞作用可增强周期时相性抗癌药依托泊苷（VP-16）体外杀伤小鼠结肠癌ct26细胞的活性。3.经刚地弓形虫体外感染24h后的小鼠结肠癌细胞接种BALB/c小鼠后,其皮下移植瘤较正常ct26细胞接种表现为成瘤时间晚,肿瘤生长缓慢,能明显增强VP-16抑瘤率和延长小鼠存活时间,而小鼠瘤组织细胞周期主要表现为S期阻滞和亚二倍凋亡峰的出现,与体外试验结果不同。4.除通过细胞周期阻滞作用协同VP-16抗癌外,在体内弓形虫尚可通过诱导荷瘤组织凋亡和坏死,下调VEGF及上调TSP1以抑制荷瘤组织微血管的形成,及纠正T淋巴细胞亚群异常和CD4+/CD8+比例失调等多方面机制来发挥抗癌作用。