研究背景和目的:结直肠癌是我国第4位最常见的恶性肿瘤,发病率呈逐年上升和年轻化趋势。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程,每一阶段都受多种基因/蛋白的调控,其中肿瘤细胞运动行为的改变和运动能力的增强是其侵袭和转移的重要步骤。　　 FMNL2是我们前期筛选出的一个新的转移相关基因[1,2],属于formins家族成员之一,formins作为目前最有效的肌动蛋白成核因子,参与了众多以肌动蛋白为基础的过程,包括细胞极性、伪足的形成、细胞运动等,并常在病理情况下如肿瘤分化、侵袭和转移中表达失调。目前关于FMNL2的功能学研究甚少,本课题组首先探讨了FMNL2与肿瘤侵袭、转移的关系,发现FMNL2在结直肠癌的表达高于正常粘膜组织,且与淋巴结转移相关[3,4]；FMNL2促进结直肠癌的侵袭及转移,参与调控Rho细胞运动信号通路[受国家自然科学基金资助No.30870945],可能通过诱导上皮一间质转化(Epithelial-MesenchymalTransition,EMT),增强结直肠癌细胞的侵袭能力[5]。此外,Kitzing等[6]发现FMNL2是一个特异性RhoC效应子,RhoC能调控FMNL2的自抑制。目前有关FMNL2在肿瘤发生及转移中的表达调控机制尚不清楚。　　 MicroRNA对基因的转录后表达调控是21世纪的一个突破性科学发现,研究显示miRNA通过靶定癌基因或肿瘤抑癌基因,发挥着类似肿瘤抑制因子或癌基因的作用,在肿瘤的发生发展中起着重要的作用[7,8]。miRNA与其调控的mRNA并非一对一的关系,每个miRNA有许多靶点mRNA,而每个mRNA受多种miRNA的调节,两者之间形成一个复杂和相互关联的调控网络。　　 本研究将探讨参与调控FMNL2基因的miRNAs及其在结直肠癌侵袭、转移中的作用及靶点miRNA参与结直肠癌的信号通路,研究将为FMNL2在肿瘤侵袭和转移中的分子机制提供新线索,为FMNL2基因和靶点miRNAs作为新的结直肠癌转移分子标志物提供科学依据。　　 研究方法　　 1.FMNL2相互作用miRNAs的筛选及鉴定　　 (1)以FMNL2基因为检索词,利用四个常用数据库microRNA.org、TargetScan、Pictar和miRanda进行相互作用miRNAs的预测,挑选预测值较高(至少三个软件均预测到)的miRNAs作为候选miRNAs;　　 (2)选取4种结直肠癌细胞株,利用real-time RT-PCR检测候选miRNAs的表达,Western blot检测FMNL2蛋白的表达,初步筛选与FMNL2相互作用的miRNAs；　　 (3)利用荧光素酶报告系统检测FMNL2与筛选出的miRNAs的结合情况,确定与FMNL2直接作用的靶点miRNAs；　　 (4)利用real-time RT-PCR和Western blot方法,检测FMNL2和靶点miRNAs在8种结直肠癌细胞株中的表达情况,并进行相关性分析；　　 (5)利用real-time RT-PCR和Western blot方法,检测FMNL2和靶点miRNAs在30对新鲜结直肠癌组织中的表达情况,并进行相关性及临床病理分析。　　 2.靶点miRNAs在结直肠癌侵袭和转移中的作用　　 (1)利用阳离子脂质体法,将商品化的靶点miRNAs inhibitor瞬时转染至结直肠癌细胞株SW480和HCT116中,用Western blot检测FMNL2的表达变化；　　 (2)设计并构建靶点miRNAs慢病毒表达载体,进行病毒包装后将之感染至结直肠癌细胞株SW620和Lovo中,用嘌呤霉素筛选并获得靶点miRNAs稳定表达的细胞株,用Western blot检测FMNL2蛋白的表达变化；　　 (3)将靶点miRNAs慢病毒表达载体和不含3UTR的FMNL2编码区表达慢病毒载体共转染至结直肠癌细胞株SW620和Lovo中,用有限稀释法筛选并获得共表达靶点miRNAs和FMNL2的稳定细胞株,用Western blot检测FMNL2的表达变化；　　 (4)利用MTT法、平板克隆形成和体外侵袭实验,检测靶点miRNAs inhibitor转染后对体外癌细胞增殖、侵袭能力的影响；　　 (5)利用MTT法、平板克隆形成和体外侵袭实验,检测靶点miRNAs表达载体及靶点miRNAs和FMNL2(不含3UTR)共表达载体转染后对体外癌细胞增殖、侵袭能力的影响；　　 (6)利用整体可视化动物模型,检测miRNAs表达载体及靶点miRNAs和FMNL2(不含3UTR)共表达载体转染后对裸鼠皮下成瘤和转移能力的影响。　　 3.靶点miRNAs参与结直肠癌信号通路的初步探讨　　 (1)利用Western blot检测靶点miRNAs表达载体及靶点miRNAs和FMNL2(不含3UTR)共表达载体转染后,PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路中p-Akt、Akt、p-MAPK、MAPK、MMP-2、MMP-9及VEGF的表达变化；　　 (2)利用Western blot检测靶点miRNAs inhibitor转染及两个信号通路抑制剂处理后,p-Akt、Akt、p-MAPK、MAPK、MMP-2、MMP-9及VEGF的表达变化。　　 研究结果　　 1.FMNL2相互作用miRNAa的筛选及鉴定　　 (1)四个数据库检索结果显示mir-137(四个软件均预测)和mir-142-3p(三个软件均预测)的预测值较高；　　 (2)Real-time RT-PCR和Western blot结果显示,在4种结直肠癌细胞株中,mir-137和FMNL2的表达趋势相反,而mir-142-3p和FMNL2的表达无明显相关性,由于microRNA对靶基因起抑制作用,初步选定mir-137可能是FMNL2相互作用miRNA:　　 (3)设计并构建FMNL23UTR表达载体以及MutFMNL2-23UTR的突变载体；荧光素酶报告系统结果显示,在转染FMNL2基因3UTR载体的实验组中,mir-137组与对照blank组、NC组相比荧光素酶活性均显著降低(P=0.006,P=0.006)；而mir-137 inhibitor组与NC inhibitor组、blank组相比,荧光素酶活性均无显著差异(P=1.000,P=1.000)。在转染MutFMNL2-23UTR突变载体的实验组中,mir-137组与blank组相比荧光素酶活性无显著差异(P=0.215),mir-137组与NC组相比荧光素酶活性明显升高(P=0.004):mir-137 inhibitor与NC inhibitor组、blank组相比,荧光素酶活性均无显著差异(P=0.748,P=0.863)。以上证明mir-137能与FMNL2基因3UTR区的两个结合片段相互作用,从而抑制了荧光素酶的活性；　　 (4)在8种结直肠癌细胞系中,real-time RT-PCR和Western blot结果显示,mir-137在8种细胞株间的表达具有显著差异(F=511.730,P<0.001):mir-137在HCT116细胞中的表达最高,且显著高于其它7种细胞中的表达(P=0.011,P=0.009,P=0.010,P=0.008,P=0.009,P=0.009,P=0.009)；mir-137在SW480细胞中的表达显著高于SW620、Lovo和Caco2细胞中的表达(P=0.000,P=0.016,P=0.008)；Western blot结果显示FMNL2在Lovo细胞中的表达最高,在SW620、Caco2、SW480、HT29和LS174t的表达逐渐降低,FMNL2在HCT116和Cola205细胞中无表达。Spearman相关性分析显示8种结直肠癌细胞株中mir-137和FMNL2二者之间存在显著的负相关关系(r=-0.753,P<0.001)；　　 (5)在30对新鲜结直肠癌配对组织中,real-time RT-PCR和Western blot结果显示,mir-137在结直肠癌组织中的表达明显低于正常粘膜组织(P<0.001),mir-137在伴有淋巴结转移的结直肠癌组和不伴有淋巴结转移的结直肠癌组之间的表达无明显差异(P=0.143)；FMNL2在癌组织中的表达高于正常粘膜组织,Spearman相关性分析显示30对结直肠癌配对组织中mir-137和FMNL2二者之间存在显著的负相关关系(r=-0.732,P<0.001)；临床病理分析显示mir-137在30例结直肠癌配对组织中的表达与患者年龄、性别、有无淋巴结转移以及肿瘤分化程度均无显著关系(P=0.744；P=0.248:P=0.118:P=0.346,P=0.289,P=0.254)。　　 2.转染mir-137 inhibitor对结直肠癌细胞体外生物学特性的影响　　 (1)将商品化的mir-137 inhibitor转染结直肠癌SW480和HCT116细胞,Western Blot结果显示,与blank和nc组相比,转染inhibitor后FMNL2蛋白的表达明显上调；　　 (2)MTT法结果显示,与blank组和nc组相比,SW480和HCT116细胞转染了mir-137 inhibitor后,细胞增殖能力明显增强(P<0.001,P<0.001；P<0.001P<0.001):　　 (3)克隆形成实验结果显示,HCT116和SW480细胞转染了mir-137 inhibitor后,细胞形成克隆的能力均提高(F=12.333,P=0.007；F=23.463,P=0.001)；　　 (4)体外侵袭实验结果显示,HCT116和SW480细胞转染了mir-137 inhibitor后,细胞侵袭能力明显增强(F=42.915,P<0.001；F=22.349,P<0.001)。以上说明,抑制mir-137能促进结直肠癌细胞的体外生长、侵袭能力。　　 3.转染mir-137慢病毒表达载体及mir-137和FMNL2(不含3’UTR)共表达载体对结直肠癌细胞体内外生物学特性的影响　　 (1)构建mir-137慢病毒表达载体,将慢病毒包装后转染至结直肠癌SW620和Lovo细胞,real-time RT-PCR结果显示,SW620和Lovo细胞株中三组间差异具有显著性(F=38.094,P<0.001；F=8.503,P=0.007),mir-137的表达在mir-137转染组明显高于mock和blank对照组(P=0.026,P=0.025；P=0.007,P=0.005)；Western Blot结果显示,SW620及Lovo细胞在转染了mir-137表达载体后FMNL2的表达下调；　　 (2)将mir-137慢病毒表达载体和FMNL2不含3UTR编码区的慢病毒载体共感染至SW620和Lovo细胞中,real-time RT-PCR结果显示,mir-137的表达在mir-137/FMNL2共转染组和mir-137转染组间无明显差异(P=0.996；P=0.735):Western Blot结果显示,在mir-137过表达后导入FMNL2,FMNL2的表达与mir-137转染组相比又重新上调；　　 (3)MTT法结果显示,与blank组和mock组相比,SW620和Lovo两种细胞在mir-137转染组的增殖能力明显降低(P<0.001,P<0.001；P<0.001,P<0.001),而mir-137/FMNL2共转染组细胞的增殖能力较mir-137转染组明显增强(P<0.001;P<0.001)；　　 (4)克隆形成实验结果显示,SW620和Lovo细胞株中4组细胞间克隆形成能力差异具有显著性(F=43.584,P<0.001；F=37.128,P<0.001)；SW620和Lovo细胞株中mir-137转染组细胞的克隆形成能力显著低于blank组、mock组及mir-137/FMNL2组(P<0.001,P<0.001,P<0.001；P<0.001,P<0.001,P<0.001):SW620细胞株中mir-137/FMNL2共转染组细胞的克隆形成能力明显高于blank组、mock组和mir-137组(P=0.007,P=0.001,P<0.001)；Lovo细胞株中mir-137/FMNL2共转染组细胞的克隆形成能力明显高于mir-137组(P<0.001),但与blank组、mock组无明显差异(P=0.486,P=0.860):　　 (5)体外侵袭实验结果显示,SW620和Lovo细胞株4组细胞间侵袭能力差异具有显著性(F=29.930,P<0.001；F=24.762,P<0.001)；SW620和Lovo细胞株中mir-137组细胞的侵袭能力比blank组、mock组和mir-137/FMNL2组显著降低(P<0.001,P<0.001,P<0.001；P<0.001,P<0.001,P<0.001);SW620细胞中mir-137/FMNL2组细胞的侵袭能力比blank组、mir-137组明显增强(P=0.044,P<0.001),而与mock组无明显差异(P=0.115)；Lovo细胞中mir-137/FMNL2组细胞的侵袭能力比blank组、mock组和mir-137组明显增强(P=0.003,P=0.001,P<0.001):　　 (6)裸鼠皮下成瘤实验显示,分别接种SW620-blank组、SW620-mock组、SW620-mir-137组和SW620-mir-137/FMNL2组细胞后,裸鼠皮下肿瘤生长具有明显组间差异(F=20.853,P<0.001)；mir-137组与blank组、mock组和mir-137/FMNL2组相比皮下肿瘤生长速度明显减慢(P=0.001,P<0.001,P=0.003),mir-137/FMNL2组的皮下肿瘤生长速度明显快于mir-137组和mock组(P<0.001,P=0.003)。免疫组化结果显示,FMNL2蛋白在mir-137/FMNL2组皮下肿瘤细胞的胞浆呈阳性表达(3/5),而在mir-137组未见阳性表达(0/5)。原位盲肠接种转移实验显示:四个组别在肝脏和肠壁可见明显的转移灶,mir-137组裸鼠出现肝脏和肠壁转移率(20％,40％)均低于blank组(60％,100％)、mock组(40％,100％),而mir-137/FMNL2组裸鼠的肝脏和肠壁转移率(60％,100％)高于mir-137组。Mir-137组肝脏和肠壁转移灶的体积及数量均小于其它三组(P=0.001,P<0.001,P=0.001；P=0.004,P=0.008,P=0.024)。　　 以上说明,mir-137的过表达能抑制结直肠癌细胞的体外增殖、侵袭能力及裸鼠体内肿瘤生长、转移能力,而FMNL2基因则能有效逆转这一抑制作用。　　 4.Mir-137参与结直肠癌信号通路的初步探讨　　 (1)Western blot结果显示,p-Akt和p-MAPK在SW620/mir-137组细胞中的活性比blank、mock组下降,SW620/mir-137/FMNL2共表达细胞中p-Akt和p-MAPK的活性较mir-137组升高,而Akt和MAPK总蛋白量在4组间无明显差异。MMP-2、MMP-9和VEGF在mir-137组中的表达比blank、mock组降低,而FMNL2导入后MMP-2、MMP-9和VEGF的表达重新升高。　　 (2)Western Blot结果显示,FMNL2在HCT116/mir-137 inhibitor组、HCT116/mir-137 inhibitor+LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂)组和HCT116/mir-137 inhibitor+UO126(MAPK/ERK信号通路抑制剂)组的表达均高于未处理组；用mir-137 inhibitor处理后,p-Akt和p-MAPK的活性增强,LY294002抑制剂处理使p-Akt的活性降低,而UO126抑制剂处理使p-MAPK活性下降；用mir-137 inhibitor处理后,MMP-2、MMP-9和VEGF的表达增高,LY294002和UO126抑制剂处理均能使MMP-2、MMP-9和VEGF的表达下降。　　 以上说明,mir-137能抑制p-Akt和p-MAPK的活性,进而使其下游的MMP-9、MMP-2和VEGF的表达下调。　　 结论　　 1.FMNL2是mir-137作用的一个新型靶基因；　　 2.Mir-137通过靶基因FMNL2抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力；　　 3.Mir-137能抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路的活化,使其下游MMP-2、MMP-9和VEGF表达下调,从而抑制结直肠癌细胞的侵袭和转移过程。