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研究背景及目的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)属于禽类病毒,可引起禽类爆发性感染,给家禽业造成严重的经济损失,被列为必须报告的A类传染病之一;同时NDV还是一种溶瘤病毒,对人类基本不致病,是很有潜力的肿瘤生物治疗候选病毒株。NDV能感染肿瘤细胞,直接诱导肿瘤细胞膜融合,引起肿瘤细胞坏死及凋亡,是该病毒抗肿瘤的主要机制之一。血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)位于病毒包膜上,是NDV主要的抗肿瘤蛋白。慢病毒(lentivirus)为二倍体RNA逆转录病毒,其载体以慢病毒的基因组为基础,去除多个与病毒致病性相关的基因序列,然后在载体基因组中插入实验所需目的基因片段。因转染效率高,慢病毒载体可感染细胞种类多,而且能容纳较大目的基因片段,因此该载体在研究上应用较广。Micro RNA是一由20-24个核苷酸组成的小RNA,在肿瘤的发展进程中具有重要作用,研究表明micro RNA-204与肺癌细胞凋亡有关;Bcl-2是一种癌基因,具有抑制凋亡的作用,与肺癌细胞凋亡有关。研究发现,转染有NDV-HN基因的肝癌细胞株细胞凋亡与NDV-HN有关,表明NDV可通过HN致肝癌细胞凋亡而起抗癌作用。本实验拟通过构建过表达HN蛋白的人肺腺癌A549细胞株,研究HN诱导肺腺癌A549细胞的凋亡情况,以及细胞micro RNA-204的表达和抗凋亡基因Bcl-2的表达,为NDV7793-HN用于抗肿瘤生物治疗的基础研究提供理论依据。方法1.由本实验室保存的带有NDV7793-HN基因全长的质粒pc DNA3.1-HN,送公司构建sf GFP-HN载体,测序鉴定NDV7793-HN。2.将sf GFP-HN质粒和辅助质粒PH1、PH2共转染于293V细胞进行慢病毒包装,收集上清液,浓缩病毒颗粒,将实验组慢病毒命名为Lv-sf GFP-HN;同时设置质粒空载对照组,同样的方法进行空载组慢病毒包装和浓缩,将空载组慢病毒命名为Lv-sf GFP。3.将所得慢病毒颗粒10倍梯度稀释,感染293V细胞,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达情况,同时利用嘌呤霉素(Puromycin)进行慢病毒滴度测定,同时进行药物筛选,挑选出稳定转染的单克隆细胞株293V-sf GFP-HN和293V-sf GFP。4.将所得慢病毒颗粒感染人肺腺癌A549细胞,感染72 h后于荧光显微镜下观察GFP表达,并更换含有Puromycin的筛选培养基进行药筛,挑选稳定转染的A549-sf GFP-HN细胞和A549-sf GFP细胞单克隆细胞株。5.流式细胞仪检测293V-sf GFP-HN细胞、293V-sf GFP细胞、A549-sf GFP-HN细胞和A549-sf GFP细胞的转染率。6.RT-PCR检测293V-sf GFP-HN细胞、293V-sf GFP细胞、293V细胞、A549-sf GFP-HN细胞和A549-sf GFP细胞转染人A549细胞后HN的m RNA的表达。7.Western blot检测A549-sf GFP-HN细胞、A549-sf GFP细胞和A549细胞HN蛋白的表达。8.RT-PCR检测A549-sf GFP-HN细胞、A549-sf GFP细胞和A549细胞micro RNA-204的表达。9.RT-PCR和Western blot检测A549-sf GFP-HN细胞、A549-sf GFP细胞和A549细胞中Bcl-2的表达。10.Western blot检测A549-sf GFP-HN细胞、A549-sf GFP细胞和A549细胞中Bcl-2蛋白的表达。11.流式细胞仪检测A549-sf GFP-HN细胞和A549细胞的凋亡及其在加顺铂后的凋亡情况。结果1.测序显示,本实验成功构建载体质粒sf GFP-HN,与实验室保存的pc DNA3.1-HN序列一致。2.sf GFP-HN转染293V细胞48 h后,荧光显微镜下观察到细胞有GFP表达,表明质粒共转染成功。3.sf GFP-HN转染293V细胞72 h后,荧光显微镜下观察到细胞有GFP表达,表明慢病毒包装成功,Puromycin滴度测定显示Lv-sf GFP-HN浓缩病毒滴度为1×10~6 TU/ml,Lv-sf GFP浓缩病毒滴度为1×10~7 TU/ml。4.sf GFP-HN转染人A549细胞72 h后,荧光显微镜下观察到人A549细胞有GFP表达,表明慢病毒成功转染人A549,用Puromycin筛选出稳定转染的A549-sf GFP-HN细胞株和A549-sf GFP细胞株。5.流式细胞仪检测293V-sf GFP-HN细胞、293V-sf GFP细胞、A549-sf GFP-HN细胞和A549-sf GFP细胞的转染率,转染效率都达到90%左右,表明细胞筛选成功。6.RT-PCR检测HN的m RNA表达结果,结果表明在293V-sf GFP-HN细胞和A549-sf GFP-HN细胞有HN的m RNA表达,而其余细胞中无HN的m RNA表达。7.Western blot结果显示A549-sf GFP-HN细胞有HN蛋白表达,而A549-sf GFP细胞和A549细胞中无HN蛋白表达。8.RT-PCR结果显示,A549-sf GFP-HN细胞的micro RNA-204表达水平较A549-sf GFP细胞和A549细胞的高。9.RT-PCR结果显示,在A549-sf GFP-HN细胞的Bcl-2的m RNA表达水平较A549-sf GFP细胞和A549细胞的低。10.Western blot结果显示,A549-sf GFP-HN细胞的Bcl-2蛋白表达水平较A549-sf GFP细胞和A549细胞的低。11.流式细胞仪检测结果显示,A549-sf GFP-HN细胞加顺铂后的凋亡率较A549细胞加顺铂后的高。结论1.为探究NDV-HN蛋白是否引起肺癌凋亡及机制,我们成功包装了慢病毒Lv-sf GFP-HN和Lv-sf GFP和构建了稳定转染A549-sf GFP-HN细胞株,并证实A549-sf GFP-HN细胞株能表达NDV-HN蛋白。2.A549-sf GFP-HN上调人肺腺癌A549细胞凋亡相关micro RNA-204的表达,同时下调A549细胞抗凋亡蛋白Bcl-2表达,且加顺铂后的A549-sf GFP-HN细胞的凋亡率大于A549细胞加顺铂后的的凋亡率,说明HN可能通过micro RNA-204来下调Bcl-2的表达,使A549-sf GFP-HN细胞对顺铂引起的凋亡率升高,初步证明HN能通过促进肺腺癌的凋亡而起到抗癌作用。