植物分子医药/农业是利用转基因植物以农业规模来生产人类所需的医药蛋白质。与微生物或动物细胞培养相比具有成本低、安全性高、易于规模化生产等优点。水稻除了作为世界上最重要的主要粮食作物之一外,目前还通过农杆菌介导的DNA转化作为分子医药的生物反应器。水稻种子作为植物生物反应器,已用于很多重组蛋白、疫苗和抗体等的生产。成纤维细胞生长因子21（FGF21）对高血糖、肥胖症等代谢疾病和肝癌的早期治疗有重要意义,有望成为治疗糖尿病、肥胖症和脂肪肝的新一代药物。微生物表达FGF21蛋白具有在胞内易形成包涵体、缺乏翻译后修饰、纯化成本高等不利因素。目前,水稻的转录组研究大多集中在生物和非生物胁迫上,而对这种DNA转化方法引起的全基因组功能改变则知之甚少,出于生物安全角度考虑,需要了解外源基因的表达对水稻代谢的影响。本研究首先利用北方寒地粳稻品种建立水稻种子生物反应器平台,然后利用水稻种子表达人源FGF21基因,在获得转FGF21水稻阳性植株和种子后,分别从农艺性状、微观结构、生理水平、转录水平和蛋白水平等不同层面,来阐述转FGF21对水稻代谢有何影响,以期为水稻生物反应器更高效、安全表达外源蛋白奠定基础。本研究获得的主要结果如下:1、高效转化技术的一个前提是组织培养系统的稳健性。不同水稻品种愈伤组织诱导和再生率的提高主要取决于生长调节剂的种类和浓度。本文对寒地粳稻品种东农427、龙稻14、东农428、龙粳25、龙稻17、空育131和垦稻19的生长调节剂组合进行了优化,其最佳组合分别是:东农427,1 mg·L^-1 2,4-D+2 mg·L^-1 6-BA+4 mg·L^-1 KIN+0.2 mg·L^-1 NAA;龙稻14,1 mg·L^-1 2,4-D+4 mg·L^-1 6-BA+4 mg·L^-1 KIN+0.5 mg·L^-1 NAA;东农428,2 mg·L^-1 2,4-D+4 mg·L^-11 6-BA+4 mg·L^-1 KIN+0.02 mg·L^-11 NAA;龙粳25,1 mg·L^-11 2,4-D+4 mg·L^-1 6-BA+2 mg·L^-1 KIN+0.2 mg·L^-1 NAA;龙稻17,1 mg·L^-11 2,4-D+4 mg·L^-11 6-BA+2 mg·L^-1KIN+0.02 mg·L^-11 NAA;空育131,1 mg·L^-1 2,4-D+6 mg·L^-1 6-BA+4 mg·L^-1KIN+0.5 mg·L^-1NAA;垦稻19,2 mg·L^-1 2,4-D+2 mg·L^-1 6-BA+4 mg·L^-1 KIN+0.2 mg·L^-1NAA。2,4-D用于诱导培养基,6-BA、KIN和NAA用于分化培养基。其中东农427和龙稻14培养力最高,故用作下一步遗传转化体系研究。2、用含有pCAMBIA 1301质粒的农杆菌EHA 105进行转化。当愈伤组织浸泡在0.272OD₆₀₀（600nm处测定光密度）10 min时,东农427的转化效率最高;龙稻14愈伤组织在0.592 OD₆₀₀的菌液中侵染20 min效果最好。两个品种的愈伤组织采用的共培养方式为:愈伤组织于无菌滤纸上1 mL液体共培养液浸湿,共培养时间均为3 d。对两个品种植株的PCR分析,证实了GUS基因的表达。东农427的转化效率优于龙稻14,故选用东农427做转FGF21的水稻遗传转化体系。3、构建植物表达载体,进行农杆菌介导的水稻转化,获得T₀代植株,PCR和RT-PCR检测得到转基因阳性植株50株,收集T₁代种子。在第二、三年分别种植,获得T₂、T₃代种子进行Western blot分析,T₂代有6个Western blot阳性株系,T₃代得到12个Western blot阳性株系。对转基因和野生型植株及种子进行农艺性状分析,除转基因成熟种子粒重比野生型显著降低,其余无显著差异。得到T₃代转基因阳性种子,进行生理分析,在淀粉和蔗糖含量及代谢相关酶活方面,转FGF21水稻与野生型水稻未成熟和成熟种子之间存在显著差异。扫描电镜分析发现,转FGF21水稻与野生型水稻成熟种子颖壳结构存在差异,转基因较野生型维管束少且排列不规整。亚细胞定位分析表明,FGF21蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。4、将野生型（CK一个株系）及转FGF21的水稻（T1、T2和T3三个株系）未成熟种子进行转录组学分析:KEGG通路分析表明,1762个差异表达基因（DEGs）主要涉及淀粉和蔗糖代谢、植物-病原体相互作用、内吞作用、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化以及半乳糖代谢。从6个通路挑选12个候选基因采用qRT-PCR证实了从RNA-Seq推断的候选DEG的差异表达,证明了RNA-Seq数据的准确和可靠。通过对以上5个通路的转录水平分析表明,FGF21转入可影响水稻淀粉和糖类代谢,进而影响种子物质积累,但FGF21转入并未引起水稻免疫应答反应以及胁迫应答响应。5、将野生型（CK）和转FGF21株系T1的成熟种子进行label free蛋白质组学分析,其中CK组共有1298个差异蛋白,其中426个上调,872个下调;T1组共有1209个差异蛋白,500个上调,709个下调;CK与T1共有1135个差异蛋白,426个上调,709个下调。按照差异倍数达到1.5倍以上,且p value<0.05进行筛选后的差异蛋白数为437个。将差异蛋白进行GO富集分析,共有1355个差异蛋白注释到了35个条目中,其中上调蛋白259个,下调蛋白1096个。对鉴定到的差异蛋白进行通路分析,结果鉴定到的996个蛋白（其中227个差异蛋白）注释到了89个通路中,其中前10条具有显著差异（p<0.05）,包括淀粉和蔗糖代谢、氨基糖与核糖代谢、赖氨酸降解、氨酰-tRNA生物合成、色氨酸代谢、过氧化物酶体、泛酸和辅酶A生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物合成。分别从淀粉和糖代谢、氨基糖与核糖代谢以及过氧化物酶体三个通路挑选9个基因做qRT-PCR分析,上调基因数为4个,下调基因数为5个,与蛋白质组预测数据吻合,证明蛋白质组数据可靠。CK和T1、T2、T3株系中两种酶OsAGPS1和OsCht5的Western blot分析结果与蛋白质组结果一致。在蛋白水平,转FGF21与野生型没有较大差别,证明转FGF21对水稻是安全的。