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【研究背景】甲卡西酮(Methcathinone,CAT)是卡西酮类的合成药,也叫“丧尸药”,是苯丙胺类β酮基的精神兴奋剂,与甲基苯丙胺具有相似的结构,能够产生欣快,运动增加,致幻等作用,也能引起高热,记忆力降低,偏执,焦虑,癫痫等毒性症状,严重者可导致残疾和死亡。早期是作为抗抑郁药得到使用,后因其副作用而被临床禁用。近年来,随着传统毒品的严厉管制和打击,而CAT因具有与苯丙胺类相似的刺激性作用,正逐步成为传统毒品的替代物在人群中广泛滥用,故关于CAT滥用、成瘾及死亡案例也相继在各国出现,因此对CAT的毒性机制的研究显得尤为重要。然而国内外对CAT毒性机制的研究甚少,大都停留在化学结构,药理作用和检测分析上,故本课题组通过建立CAT中毒模型,对CAT的神经毒性机制进行初步探索。CAT与苯丙胺类药物在化学结构与药理学方面相似,两者均通过增加细胞外单胺类神经递质如多巴胺(Dopane,DA)、5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)等的浓度发挥毒性作用,且实验发现苯丙胺类抑制剂能对CAT滥用患者产生保护性效果。此外,研究发现CAT的前体物质能导致氧化应激相关酶如过氧化氢酶(Catalase,CAT)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)等活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量改变,并产生神经元凋亡。早期动物实验曾表明CAT导致行为学改变与ROS产生相关。已有大量实验证实氧化应激是甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)的主要神经毒性机制。基于上述发现及CAT与METH在化学结构与毒理学上的相似性,大多数学者认为CAT的神经毒性机制可能涉及氧化应激。一般情况下,体内氧化与抗氧化处于动态平衡。在化学性、物理学及生物学等因素刺激下,产生氧化应激,即氧化活性物质产生过多,体内抗氧化剂无法将其完全清除。过多的活性氧物质(氧自由基)与细胞结构物质(如DNA)结合,致机体损伤。N-乙酰半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine,NAC)作为一强有效的小分子抗氧化物质,脂溶性高,易通过血脑屏障,常被用于氧化应激的研究。故本实验通过利用抗氧化剂NAC对CAT染毒大鼠进行预处理,检测不同组氧化应激相关酶的活性,观察各组大脑自噬相关蛋白的表达水平,及神经元凋亡情况,对CAT的氧化应激毒性机制进行研究。【研究目的】1、CAT对成年大鼠基本毒性观察2、CAT神经毒性中氧化应激机制作用3、CAT神经毒性中自噬相关蛋白表达情况4、CAT神经毒性中神经元凋亡情况5、抗氧化剂对CAT染毒大鼠的保护价值【研究方法】1、建立CAT中毒模型及基本毒性观察SD(Sprague-Dawley)成年雄性大鼠,共24只(160g-200g),12h光暗循环交替,自由进食与饮水。随机分为对照组,实验组,抑制+实验组及抑制组四组,各组大鼠给药方式均为腹腔注射(i.p.),对照组每日给以0.9%Nacl处理,每次1ml,连续15日;实验组前三日为0.9%Nacl,第4-15日为CAT(0.5mg/kg);抑制组+实验组,前三日只给以抑制剂NAC(150mg/kg),第4-15日,在CAT给药前30min注射NAC;抑制组给以抑制剂NAC(150mg/kg),连续15日。最后一次用药24h后,断头处理,取出脑组织。实验过程观察大鼠体重、体温及行为学改变;各组大鼠脑组织HE染色,观察病理改变。2、CAT染毒后神经毒性中氧化应激机制的研究用超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathinone peroxidase,GSH-PX)、谷胱甘肽(Glutathinone,GSH)及丙二醛检测试剂盒对各组大鼠脑组织中SOD、CAT、GSH-PX、GSH及MDA进行活性检测;利用Western blot技术对各组脑组织Atg-7、beclin-1及LC3蛋白表达情况进行检测;用TUNEL技术对大鼠脑组织各部位进行染色,观察凋亡情况。3、实验数据统计和分析实验数据均以均数±标准差(Mean±SD)表示,行单因素方差分析(one-way ANOVA),用LSD-t检验进行组间分析,设P<0.05具有统计学意义。所有数据和图表均采用GraphPad Prism5及SPSS19分析。【研究结果】1、腹腔注射CAT后,各组间体重无显著性差异;CAT药物注射前后体温较其他三组具有明显改变(P<0.05),刻板行为评分结果较其他三组具有显著改变(P<0.05),表现为活动增多,重复性探索样抬头,转圈行为等。而经NAC预处理后的CAT+NAC组,与NS组相比,大鼠的刻板行为评分和体温变化无明显改变。HE染色显示神经元水肿,神经元变性,并见噬神经现象。2、与其他三组比较,实验组抗氧化相关酶SOD、GSH-PX、CAT及GSH活性出现明显下降(P<0.05);MDA含量出现显著性升高(P<0.05);而经NAC预处理后的CAT+NAC组,与NS组比较抗氧化相关酶SOD、GSH-PX、CAT及GSH活性无明显差异,MDA含量无明显改变。3、Western blot检测结果:与其他三组比较,CAT组beclin-1,Atg-7的表达量出现明显升高(P<0.05),LCⅡ/LCⅠ的比值出现明显升高(P<0.05);而经NAC处理后的CAT+NAC组与对照组相比,beclin-1,Atg-7的表达量无明显差异,LCⅡ/LCⅠ的比值无明显改变。4、TUNEL染色结果显示,CAT组阳性细胞增多,即神经元凋亡增加,阳性指数呈上升趋势,与其他三组相比具有统计学差异(P<0.05);而经NAC预处理后的CAT+NAC组,与对照组相比无明显差异。【研究结论】1、甲卡西酮染毒后体温升高、存在刻板行为、脑组织出现相应病理学改变。2、氧化应激是甲卡西酮神经毒性作用的重要机制之一。3、甲卡西酮会引起自噬、凋亡增加。4、抗氧化剂可有效拮抗甲卡西酮所致的氧化应激损伤及自噬和凋亡效应。