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研究背景及目的乳腺癌是女性恶性肿瘤之一,晚期患者生存时间较短,患者手术治疗后复发转移的风险日益增大。乳腺癌复发转移是一个多因素的复杂过程,癌细胞可以通过侵入血管以及淋巴管的途径实现转移。其中淋巴道转移是乳腺癌常见的转移方式,很多患者往往早期已经出现淋巴结转移现象。Neμropilin-1(NRP-1)与多种细胞因子的信号传递有关,在肿瘤增殖、粘附、转移、淋巴管及血管形成中发挥重要作用。它的表达直接影响多种肿瘤的恶性程度,目前NRP-1被认为是癌症的一个很有前景的潜在治疗靶点。但关于NRP-1对乳腺癌细胞的生物活性及其对乳腺癌新生淋巴管形成的作用尚不清楚。本文旨在以转移性乳腺癌MDA-MB-231为研究对象,通过RNA干扰及功能性单克隆抗体阻断方法抑制NRP-1功能,观察NRP-1对乳腺癌细胞生物活性及其对于淋巴管生成的影响,并通过检测分析NRP-1与PI3K、AKT相关信号分子的表达,阐明NRP-1/PI3K/AKT信号通路调控乳腺癌生物学特性的分子机制,为靶向NRP-1分子的肿瘤治疗提供新的思路和理论依据。实验方法1.利用NRP-1的b1b2片段(NRP-1-b1b2)作为免疫原,免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠;构建、筛选稳定分泌NRP-1-b1b2的单克隆抗体的杂交瘤细胞株;杂交瘤细胞扩大培养,接种于Balb/c小鼠腹腔中;获得含有NRP-1 mAb的腹水,然后rProteinA亲和柱纯化单克隆抗体;SDS-PAGE电泳检测NRP-1 mAb的纯度;间接ELISA鉴定活性;共聚焦荧光扫描显微镜观察NRP-1mAb在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的分布定位。2.运用RNAi技术,设计并合成4对寡核苷酸序列,其中3对为靶向NRP-1的特异性干扰序列,1对为非特异性对照序列(non-target);构建PLV-NRP-1shRNA重组质粒,以脂质体Lipofectamine 2000转染试剂将携带NRP-1-shRNA的质粒转染MDA-MB-231细胞。转染细胞后,用荧光显微镜观察转染效率,使用BSD药物进行初步筛选,并采用Real-time PCR以及Western blot方法检测NRP-1基因和蛋白表达情况,鉴定出稳转细胞株。3.通过NRP-1 mAb及RNAi抑制乳腺癌中NRP-1的表达,采用MTT法检测各组MDA-MB-231细胞增殖,划痕实验检测各组细胞迁移能力和流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。4.分别收集NRP-1 mAb和RNAi组的MDA-MB-231细胞的培养上清,制备HLECs的条件培养基,或建立将NRP-1表达降低后的MDA-MB-231细胞与HLECs共培养系统,通过CCK-8法、小管形成实验、小室迁移及侵袭实验,观察HLECs增殖能力、体外小管形成能力和迁移侵袭能力。5.在体内实验中,建立乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤模型:各处理组乳腺癌细胞分别注射到裸鼠右腿根部皮下,形成实体瘤模型,观察NRP-1RNAi和NRP-1 mAb组对乳腺癌裸鼠移植瘤生长抑制的影响;qPCR、WB、IHC检测NRP-1、VEGFR、PI3K、AKT及其磷酸化水平;HE染色形态学观察不同处理组之间组织血管密度的变化。实验结果1.实验结果显示本实验室制备的NRP-1单克隆抗体纯度和亲和力较高,共聚焦扫描实验结果显示抗体主要定位在乳腺癌细胞膜表面。2.构建的PLV-NRP-1RNAi转染MDA-MB-231效率在60%以上,经筛选鉴定获得两个干扰效果较佳的稳转细胞株:NRP-1shRNAi1#、NRP-1shRNAi1143#。3.不同浓度的NRP-1mAb以及不同程度的NRP-1 RNA干扰表达后均能抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长增殖和迁移,并促进其凋亡,且生长抑制作用呈剂量依赖性。4.结果显示在MDA-MB-231与HLECs共培养体系中,HLECs的迁移侵袭均受到明显抑制。其中,24以及48h条件培养基均能抑制淋巴管的迁移和侵袭,48h抑制较为明显。在条件培养基处理HLECs体系中,结果显示,乳腺癌细胞中NRP-1的降低对HLECs增殖以及体外小管形成抑制效果尤为明显;小管形成实验中8h和16h后HLECs小管网状结构形成均受到抑制,16h抑制效果较为明显,且NRP-1在乳腺癌细胞中的抑制程度越大,HLECs受到的抑制效果越明显。5.体内实验发现,NRP-1RNAi和NRP-1mAb乳腺癌细胞接种至裸鼠,观察到与对照组相比,各处理组移植瘤的抑瘤率明显增大NRP-1mAb 200μg/ml(高剂量组)达 45.23%,NRP-1RNAish1143#达 83.33%。6.qPCR和WB结果显示无论是在体外细胞水平,还是体内组织水平,NRP-1表达量降低的同时,VEGFR、PI3K和AKT的磷酸化水平的表达量随之下降。免疫组织化学染色显示NRP-1 mAb和RNAi组的NRP-1、VEGFR,PI3K、AKT及其蛋白磷酸化水平表达量较对照组均有明显下降。结论1.NRP-1RNAi和NRP-1mAb两种处理方式均有显著抑制人转移性乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移并促进其凋亡作用,说明NRP-1参与调控乳腺癌细胞的生物学行为,与乳腺癌的发生发展密切相关。2.NRP-1RNAi和NRP-1mAb两种处理方式下调乳腺癌细胞NRP-1,能抑制HLECs的增殖、迁移、侵袭和体外小管形成。3.干扰NRP-1表达或NRP-1mAb处理抑制NRP-1功能,对乳腺癌移植瘤生长有一定的抑制作用,表明NRP-1参与调控体内乳腺癌生长。4 NRP-1的下调,伴随PI3K/AKT信号轴关键分子活性降低,表明NRP-1可以通过PI3K/AKT信号通路参与乳腺癌细胞生物学特性与淋巴管转移过程的调控。